Çfarë është një gumë në mjekësi. Reagimi imunitar i fluoreshencës (gumë). Përgatitja për procedurën

Testi i imunofluoreshencës (IF) është një test serologjik që zbulon antitrupa ndaj antigjeneve të njohura. Metoda konsiston në mikroskopinë e njollave me njolla.

Ky reagim përdoret në imunologji, virologji dhe mikrobiologji. Kjo ju lejon të përcaktoni praninë e viruseve, baktereve, kërpudhave, protozoarëve dhe ICC. RIF përdoret gjerësisht në praktikën diagnostike për zbulimin e antigjeneve virale dhe bakteriale në materialin infektiv. Metoda bazohet në aftësinë e fluorokromit për t'u lidhur me proteinat pa cenuar specifikën e tyre imunologjike. Përdoret kryesisht në diagnostikimin e infeksioneve të traktit urinar.

Ekzistojnë metodat e mëposhtme të kryerjes së reaksionit të imunofluoreshencës: direkte, indirekte, me komplement. Metoda e drejtpërdrejtë konsiston në ngjyrosjen e materialit me fluorokrom. Për shkak të aftësisë së antigjeneve të mikrobeve ose indeve për të ndriçuar në rrezet UV të një mikroskopi fluoreshent, ato përcaktohen si qeliza me një kufi të gjelbër me ngjyra të ndezura.

Metoda indirekte konsiston në përcaktimin e kompleksit antigjen+antitrup. Për ta bërë këtë, materiali eksperimental trajtohet me antitrupa të serumit antimikrobik të lepurit të destinuar për diagnostikim. Pasi antitrupat lidhen me mikrobet, ato ndahen nga ato të palidhura dhe trajtohen me serum anti-lepuri të etiketuar me fluorokrom. Pas kësaj, mikroskop kompleks + antitrupa animikrobikë + antitrupa kundër lepurit përcaktohet duke përdorur një mikroskop ultravjollcë në të njëjtën mënyrë si në metodën direkte.

Reaksioni i imunofluoreshencës është i domosdoshëm në diagnostikimin e sifilizit. Nën ndikimin e fluorokromit, agjenti shkaktar i sifilisit përcaktohet si një qelizë me një kufi të verdhë-jeshile. Mungesa e shkëlqimit do të thotë që pacienti nuk është i infektuar me sifiliz. Kjo analizë shpesh përshkruhet me një reagim pozitiv Wasserman. Kjo metodë është shumë efektive në diagnostikim, pasi ju lejon të identifikoni patogjenin fazat e hershme sëmundjet.

Përveç faktit që RIF ju lejon të diagnostikoni sifilizin, përdoret gjithashtu për të përcaktuar praninë e patogjenëve si klamidia, mykoplazma, trichomonas, si dhe patogjenët e gonorresë dhe herpesit gjenital.

Për analiza, përdoren njolla ose gjaku venoz. Procedura për marrjen e njollosjes është plotësisht pa dhimbje dhe nuk paraqet ndonjë rrezik. Përgatituni për këtë analizë. Dymbëdhjetë orë para tij, nuk rekomandohet përdorimi i produkteve higjienike, të tilla si pak ose xhel. Gjithashtu, ndonjëherë, sipas dëshmisë së mjekut, kryhet një provokim. Për ta bërë këtë, ata rekomandojnë marrjen e ushqimit pikant ose alkoolit, ose kryerjen e një injeksioni të një lënde provokuese, të tilla si gonovacina ose pirogenal. Përveç kësaj, intervali ndërmjet barna antibakteriale dhe dorëzimi i analizës duhet të jetë së paku katërmbëdhjetë ditë.

Gjatë vlerësimit të rezultateve, duhet të merret parasysh fakti se luminescenca vërehet jo vetëm në bakteret e gjalla, por edhe në ato të vdekura, veçanërisht për klamidia. Pas një kursi antibiotikësh, qelizat e vdekura të klamidias gjithashtu shkëlqejnë.

Me përgatitjen e duhur të pacientit dhe respektimin e teknikës së marrjes së një njollosjeje, kjo analizë ju lejon të identifikoni sëmundjet në fazat e hershme, gjë që është shumë e rëndësishme për trajtim në kohë. Aspektet pozitive të kësaj metode janë koha e shkurtër për të marrë rezultatin, lehtësia e zbatimit dhe kostoja e ulët e analizës.

Disavantazhet përfshijnë faktin se një sasi mjaft e madhe e materialit në studim kërkohet për analizë. Për më tepër, vetëm një specialist me përvojë mund të vlerësojë rezultatet.

Imunoblotting[nga anglishtja. blot, spot] - një metodë për identifikimin e Ag (ose AT) duke përdorur serumet e duhura të njohura (ose Ag). Në praktikë, ato përdoren për të identifikuar HIV Ag. Fillimisht, virusi Ag izolohet me elektroforezë në xhel poliakrilik (në praktikë, kjo procedurë nuk kryhet, por përdoret një reagent tregtar). Pastaj një bartës (film nitrocelulozë ose letër e aktivizuar) aplikohet në shiritat e precipitatit dhe elektroforeza vazhdon. Pas kësaj, serumi i pacientit aplikohet në film dhe inkubohet.

Pas larjes së palidhur në AT (nëse ka), ELISA- Një antiserum i etiketuar me enzimë kundër Ig-së njerëzore dhe një substrat kromogjen që ndryshon ngjyrën kur ndërvepron me enzimën aplikohen në film. Në prani të komplekseve Ag-AT-antiserum ndaj lg, shfaqen njolla me ngjyrë në bartës (Fig. 10-20).

Reagimi i imunofluoreshencës (RIF)

Reagimi i imunofluoreshencës (REEF) u zhvillua nga A. Koons (1941) dhe bazohet në përdorimin e AT të etiketuar me ngjyra fluorokrom. Antitrupa të tillë, duke lidhur antigjenë të ndryshëm, bëjnë që komplekset imune të shkëlqejnë në rrezet UV të një mikroskopi fluoreshent. Në praktikë, ka disa opsione REEF.

Aktualisht, përdoren gjerësisht testet serologjike (SR), në të cilat përfshihen antigjenet ose antitrupat e etiketuar. Këto përfshijnë imunofluoreshencën, radioimmunoassay, immunoassay enzimë, imunoblotting, citometria e rrjedhës dhe mikroskopi elektronike.

Ato aplikojnë:

1) për serodiagnozë sëmundjet infektive d.m.th., për të zbuluar antitrupa duke përdorur një grup antigjenesh të njohur të konjuguar (të kombinuar kimikisht) me etiketa të ndryshme (enzima, ngjyra fluorokrom);

2) për të përcaktuar mikroorganizmin ose serovarin e tij duke përdorur antitrupa diagnostikues të etiketuar standarde (diagnostikë e shpejtë).

Gatim serumet diagnostike imunizimi i kafshëve me antigjenin përkatës, pastaj imunoglobulinat izolohen dhe konjugohen me ngjyra ndriçuese (fluorokrome), enzima, radioizotope.

Antitrupat monoklonal diagnostik përftohen duke përdorur qeliza hibride të formuara nga bashkimi i një limfociti B imunitar me një qelizë mielomë. Hibridomat janë në gjendje të shumohen me shpejtësi in vitro në kulturën qelizore dhe të prodhojnë imunoglobulinë karakteristike për limfocitin B të marrë.

SR-të e etiketuara nuk janë inferiore ndaj SR-ve të tjera në specifikë dhe ato i tejkalojnë të gjitha SR-të në ndjeshmërinë e tyre.

Reagimi i imunofluoreshencës (RIF)

Si etiketë përdoren ngjyra të ndezura fluorokrom (fluorescein isothiocyanate, etj.).

Ka modifikime të ndryshme të RIF. Për të shprehur - diagnostikimin e sëmundjeve infektive - për të zbuluar mikrobet ose antigjenet e tyre në materialin e testimit, përdoret RIF sipas Koons.

Ekzistojnë dy metoda të RIF sipas Koons: direkte dhe indirekte.

Komponentët e drejtpërdrejtë RIF:

1) materiali në studim (jashtëqitja, shkarkimi i nazofaringit, etj.);

2) serum imun specifik i etiketuar që përmban antitrupa ndaj antigjenit të dëshiruar;

3) tretësira izotonike e klorurit të natriumit.

Një njollë nga materiali i testimit trajtohet me antiserum të etiketuar.

Ndodh një reaksion AG-AT. Ekzaminimi mikroskopik lumineshent në zonën ku janë lokalizuar komplekset AG-AT zbulon fluoreshencën e etiketës (Fig. 34).

Komponentët RIF indirekte, e destinuar për diagnostikimin e shprehur të gripit A:

1) larja e materialit testues nga nazofaringu i një pacienti me dyshime për grip;

2) antiserum specifik me antitrupa kundër virusit të influencës A;

3) serum antiglobulin (AT kundër imunoglobulinës) i etiketuar me fluorokrom;

4) tretësira izotonike e klorurit të natriumit.

Një njollë nga materiali i testimit trajtohet fillimisht me serum imunitar ndaj antigjenit të dëshiruar, dhe më pas me serum të etiketuar antiglobulin.

Komplekset imune AG-AT - etiketuar AT zbulohen duke përdorur një mikroskop fluoreshent.

Avantazhi i metodës indirekte është se nuk ka nevojë të përgatitet një gamë e gjerë serumesh specifike fluoreshente dhe përdoret vetëm një serum antiglobulin fluoreshent.

Për diagnoza serologjike e gripit A, domethënë për të zbuluar antitrupat kundër virusit të influencës A në serumin e gjakut duke përdorur RIF indirekte përdorni influenza diagnosticum (antigjeni i virusit të influenzës A). Serodiagnostika infeksionet viraleështë kryesisht retrospektive dhe përdoret për të konfirmuar diagnozën dhe analizën epidemiologjike.

Analiza imunosorbente e lidhur me enzimën (ELISA): metoda konkurruese (përcaktimi i HBs-AG të virusit të hepatitit B) dhe metoda indirekte (diagnoza serologjike e infeksionit HIV)

Analiza e imunitetit enzimë (ELISA)

Si etiketë përdoren enzimat: peroksidaza, fosfataza alkaline etj.

Treguesi i reaksionit është aftësia e enzimave për të shkaktuar reaksione me ngjyra kur ekspozohen ndaj substratit të duhur. Për shembull, substrati për peroksidazën është një zgjidhje e ortofenildiaminës (OPD) ose tetrametilbenzidinës (TMB).

ELISA më e përdorur gjerësisht në fazën e ngurtë (Fig. 35), metoda indirekte dhe konkurruese (Fig. 36).

Rezultatet e ELISA mund të vlerësohen vizualisht dhe duke matur densitetin optik në një spektrofotometër (analizues ELISA).

Përfitimet e ELISA përfshijnë:

Thjeshtësia e metodave të vlerësimit të përgjigjeve;

Stabiliteti i konjugateve;

Lehtësisht i përshtatshëm për automatizimin.

Llojet e mëposhtme të ELISA janë dhënë si shembuj:

A) lloji konkurrues

Projektuar për të zbuluar antigjenin sipërfaqësor të virusit të hepatitit B (HBs Ag) në serumin e gjakut dhe plazmën gjatë diagnostikimit hepatiti viral B dhe përcaktimi i bartjes së HBs Ag.

Komponentët:

1) materiali i testimit - serumi ose plazma e gjakut;

2) antitrupat ndaj HBs Ag të përthithur në sipërfaqen e një pusi të një mikropllake polistireni;

3) konjugat - antitrupa monoklonal të miut ndaj HBs Ag të etiketuar me peroksidazë;

4) ortofenilendiamine (OPD) - substrat;

5) tampon fosfat-kripur;

6) serumet e kontrollit:

Pozitiv (serum me HBs Ag);

Negative (serum pa HBs Ag).

Progresi:

2. Inkubimi 1 orë në 37°C.

3. Larja e puseve.

4. Paraqitja e konjugatit.

5. Inkubimi 1 orë në 37°C.

6. Larja e puseve.

7. Prezantimi i OFD. Në prani të HBs Ag, tretësira në puset zverdhet.

8. Llogaritja e ELISA kryhet me densitet optik duke përdorur një fotometër. Shkalla e densitetit optik do të jetë në përpjesëtim të zhdrejtë me përqendrimin e HBs Ag.

Reagimi zhvillohet në tre faza:

1. HBs Ag i serumit (plazmës) të studiuar lidhet me antitrupat homologë të përthithur në sipërfaqen e pusit. Formohet IR AG-AT. (HBs Ag - anti HBs AT).

2. Antitrupat ndaj HBs Ag të etiketuar me peroksidazë lidhen me përcaktuesit e mbetur të lirë të HBs Ag të kompleksit AG-AT. Formohet një kompleks AT të etiketuar me AT-AG (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT të etiketuar me peroksidazë).

3. OPD ndërvepron me peroksidazën e kompleksit AT-AG-AT dhe ndodh ngjyrosja e verdhë.

B) tipi indirekt

Është reagimi kryesor i testit për diagnostikimin e infeksionit HIV.

Qëllimi: Diagnoza serologjike e infeksionit HIV - zbulimi i antitrupave ndaj antigjeneve HIV.

Komponentët:

1) materiali testues - serumi i gjakut (AB në AG-m HIV);

2) peptide sintetike që imitojnë 2 antigjene HIV: gp 120 dhe gp 41, të absorbuara në sipërfaqen e një pusi polistiren;

3) serumi antiglobulin i etiketuar me peroksidazë i marrë nga imunizimi i lepujve me globulina njerëzore (AT në AT);

5) kripë e kripur e puferuar me fosfat;

6) serumet e kontrollit:

pozitive;

Negativ.

Progresi:

1. Prezantimi i serumeve të kontrollit dhe testimit.

2. Inkubimi 30 minuta në 37°C.

3. Pastrimi.

4. Futja e serumit antiglobulin të etiketuar me enzimë.

5. Inkubimi 30 minuta në 37°C.

6. Pastrimi.

7. Prezantimi i OFD.

Reagimi zhvillohet në 3 faza:

1. Antitrupat ndaj HIV të serumit të studiuar lidhen me antigjenet homologe (gp 120 dhe gp 41), dhe IR AG-AT (HIV AG - AT ndaj HIV) formohet në sipërfaqen e sorbentit.

2. Formimi i IC AG-AT-AT të etiketuar me peroksidazë, pasi Antitrupat e serumit të studiuar janë antigjene për serumin antiglobulin.

3. OPD ndërvepron me peroksidazën e kompleksit AG-AT-AT dhe shfaqet një ngjyrim i verdhë i tretësirës së pusit. Diplomë aktiviteti enzimatikështë në përpjesëtim të drejtë me përqendrimin e antitrupave të studiuar.

Reagimi bazohet në faktin se serumet imune trajtohen me fluorokrome (FITC), të cilat kombinohen me antitrupa. Serumet nuk e humbin specifikën e tyre imune. Kur serumi luminescent që rezulton ndërvepron me antigjenin përkatës, formohet një kompleks ndriçues specifik, i cili është lehtësisht i dukshëm në një mikroskop luminescent.

Serume të ndryshme imunofluoreshente mund të përdoren për imunofluoreshencë direkte dhe indirekte. Në metodën direkte, për çdo mikrob përgatiten serume imune fluoreshente specifike duke imunizuar një lepur me një kulturë të vrarë të patogjenit, më pas serumi imunitar i lepurit kombinohet me fluorokrom (izocianat fluorescein ose izotiocianat). Metoda përdoret për diagnostikim të shprehur për të zbuluar antigjenet bakteriale ose virale.

Metoda indirekte përfshin përdorimin e serumit imunitar diagnostik jo-fluoreshent (lepuri i imunizuar ose person i sëmurë) dhe serumi fluoreshent që përmban antitrupa kundër globulinave të llojeve të serumit diagnostikues.

Puna numër 3

Analiza e imunitetit enzimë (IFA)

Analiza imunosorbente e lidhur me enzimën (ELISA) përdoret gjerësisht. Bazohet në faktin se proteinat absorbohen fuqishëm në pllaka, për shembull, nga klorur polivinil. Një nga variantet më të zakonshme të ELISA në praktikë bazohet në përdorimin e antitrupave specifikë të etiketuar me enzimë të të njëjtit specifikë. Një tretësirë ​​me antigjenin e analizuar i shtohet bartësit me antitrupa të imobilizuar. Gjatë inkubacionit, në fazën e ngurtë formohen komplekse specifike antigjen-antitrupa. Më pas, transportuesi lahet nga komponentët e palidhur dhe shtohen antitrupa homologë të etiketuar me një enzimë, të cilët lidhen me valencat e lira të antigjenit në komplekse. Pas një inkubimi të dytë dhe heqjes së tepërt të këtyre antitrupave të etiketuar me enzimë, përcaktohet aktiviteti enzimatik në transportues, vlera e të cilit do të jetë në përpjesëtim me përqendrimin fillestar të antigjenit në studim.

Në një variant tjetër të ELISA, serumi i testit i shtohet antigjenit të imobilizuar. Pas inkubimit dhe heqjes së komponentëve të palidhur duke përdorur antitrupa antiglobulinikë të etiketuar me enzimë, zbulohen imunokomplekse specifike. Kjo skemë është një nga më të zakonshmet në vendosjen e ELISA.

Materiali specifik i provës - Substrati specifik i antitrupave

antitrupa patogjen me peroksidazë për peroksidazën

Hetuar AGS, etiketuar

serum peroksidaza Substrati për

Peroksidaza specifike

Kontrolli:

Serum pozitiv - imun i etiketuar me peroksidazë + substrat - 2 puse;

Serum negativ - normal + substrat - 2 puse.

Ekzistojnë dy mundësi për vendosjen e RIF (reaksioni Coons) - reagimet e imunofluoreshencës direkte dhe indirekte.

RIF i drejtpërdrejtë është një reagim i thjeshtë me një hap, por meqenëse kërkon një sasi të madhe

serumet antimikrobiale të etiketuara, atëherë më rrallë janë indirekte, prodhimi i të cilave sigurohet nga një antiserum i etiketuar.

RIF indirekte është një reaksion me dy faza në të cilin antigjeni lidhet fillimisht me serumin e specieve të paetiketuara, dhe më pas kompleksi imunitar antigjen-antitrup i formuar trajtohet me antiserum të etiketuar me FITC që përmban antitrupa kundër imunoglobulinës së këtij kompleksi. Zakonisht, në fazën I të formulimit të tij, serumi imunitar i lepurit i marrë nga imunizimi i kafshëve me mikroorganizmin përkatës përdoret si serum i specieve, dhe në fazën II, serumi anti-lepuri i etiketuar me FITC i gomarëve ose kafshëve të tjera të imunizuara me gama globulina lepuri. Fig. 9).

Cilësimi i drejtpërdrejtë RIF. Në një rrëshqitje qelqi pa yndyrë, njolla të holla bëhen nga materiali i provës, dhe njolla-ngulitje bëhen nga organet dhe indet. Përgatitjet thahen, fiksohen, mbi to aplikohet serumi luminescent i marrë në hollimin e punës dhe vendoset në një dhomë të lagësht në një temperaturë prej 37 ° C për 20-30 minuta (për 25-40 minuta - në temperaturën e dhomës). Më pas, për të hequr antitrupat e tepërt fluoreshente, preparati lahet në solucion izotonik të klorurit të natriumit për 10-15 minuta, pasuar nga shpëlarja në ujë të distiluar ose të rrjedhshëm për 10 minuta. Thani në temperaturën e dhomës dhe ekzaminojeni nën një mikroskop fluoreshent duke përdorur një sistem zhytjeje vaji.

Për të vlerësuar intensitetin e fluoreshencës specifike të qelizave bakteriale, përdoret një shkallë katër plus: "++++", "+++" - shumë e ndritshme dhe e ndritshme; "++", "+" - fluoreshencë e theksuar dhe e dobët e gjelbër e zorrës së trashë të qelizave. Tre kontrolle janë të detyrueshme: 1) trajtimi me antitrupa fluoreshente të baktereve homologe (kontrolli pozitiv); 2) kultura heterologjike (kontrolli negativ); 3) material i pa infektuar (kontroll negativ).

RIF antikomplementare. Reagimi është një modifikim i CSC, në të cilin antitrupat antikomplementar të etiketuar me FITC shërbejnë si një sistem tregues (Fig. 10).

RIF anti-komplementar indirekt është vendosur si më poshtë: preparati i antigjenit përgatitet në një rrëshqitje qelqi, si për RIF, por në fazën I përpunohet jo me një serum imunitar, por me përzierjen e tij me komplementin e derrit gini, dhe në fazë II me një antiserum që përmban antitrupa të etiketuar me FITC për të plotësuar . Përdorimi i gjerë i RIF anti-komplementar kufizohet nga vështirësia e marrjes së antitrupave anti-plotësues dhe mënyra se si ato janë "etiketuar".