चिकित्सा में एक चट्टान क्या है। प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया (रीफ)। प्रक्रिया की तैयारी

इम्यूनोफ्लोरेसेंस टेस्ट (आईएफ) एक सीरोलॉजिकल टेस्ट है जो ज्ञात एंटीजन के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाता है। विधि में सना हुआ स्मीयरों की माइक्रोस्कोपी शामिल है।

इस प्रतिक्रिया का उपयोग इम्यूनोलॉजी, वायरोलॉजी और माइक्रोबायोलॉजी में किया जाता है। यह आपको वायरस, बैक्टीरिया, कवक, प्रोटोजोआ और आईसीसी की उपस्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है। संक्रामक सामग्री में वायरल और बैक्टीरियल एंटीजन का पता लगाने के लिए नैदानिक ​​अभ्यास में आरआईएफ का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। यह विधि फ्लोरोक्रोम की क्षमता पर आधारित है कि वह प्रोटीन को उनकी प्रतिरक्षात्मक विशिष्टता का उल्लंघन किए बिना बांध सके। यह मुख्य रूप से मूत्र पथ के संक्रमण के निदान में प्रयोग किया जाता है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया को अंजाम देने के निम्नलिखित तरीके हैं: प्रत्यक्ष, अप्रत्यक्ष, पूरक के साथ। प्रत्यक्ष विधि में फ्लोरोक्रोम के साथ सामग्री को धुंधला करना शामिल है। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की यूवी किरणों में रोगाणुओं या ऊतकों के एंटीजन की चमकने की क्षमता के कारण, उन्हें चमकीले रंग की हरी सीमा वाली कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया जाता है।

अप्रत्यक्ष विधि में एंटीजन + एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स का निर्धारण होता है। ऐसा करने के लिए, प्रायोगिक सामग्री का निदान के लिए लक्षित रोगाणुरोधी खरगोश सीरम के एंटीबॉडी के साथ इलाज किया जाता है। एंटीबॉडी के रोगाणुओं से बंधे होने के बाद, उन्हें उन लोगों से अलग किया जाता है जो बाध्य नहीं होते हैं और फ्लोरोक्रोम के साथ लेबल किए गए एंटी-खरगोश सीरम के साथ इलाज किया जाता है। उसके बाद, जटिल सूक्ष्म जीव + रोगाणुरोधी एंटीबॉडी + एंटी-खरगोश एंटीबॉडी को एक पराबैंगनी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उसी तरह निर्धारित किया जाता है जैसे प्रत्यक्ष विधि में होता है।

उपदंश के निदान में इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया अपरिहार्य है। फ्लोरोक्रोम के प्रभाव में, उपदंश के प्रेरक एजेंट को एक पीले-हरे रंग की सीमा वाली कोशिका के रूप में निर्धारित किया जाता है। चमक की अनुपस्थिति का अर्थ है कि रोगी उपदंश से संक्रमित नहीं है। यह विश्लेषण अक्सर एक सकारात्मक वासरमैन प्रतिक्रिया के साथ निर्धारित किया जाता है। यह विधि निदान में बहुत प्रभावी है, क्योंकि यह आपको रोगज़नक़ की पहचान करने की अनुमति देती है प्रारंभिक चरणबीमारी।

इस तथ्य के अलावा कि आरआईएफ आपको सिफलिस का निदान करने की अनुमति देता है, इसका उपयोग क्लैमाइडिया, माइकोप्लाज्मा, ट्राइकोमोनास जैसे रोगजनकों के साथ-साथ गोनोरिया और जननांग दाद के रोगजनकों की उपस्थिति को निर्धारित करने के लिए भी किया जाता है।

विश्लेषण के लिए, स्मीयर या शिरापरक रक्त का उपयोग किया जाता है। स्मीयर लेने की प्रक्रिया पूरी तरह से दर्द रहित होती है और इससे कोई खतरा नहीं होता है। इस विश्लेषण की तैयारी करें। इसके बारह घंटे पहले, स्वच्छता उत्पादों, जैसे कि थोड़ा या जैल का उपयोग करने की अनुशंसा नहीं की जाती है। साथ ही, कभी-कभी, डॉक्टर की गवाही के अनुसार, उकसावे को अंजाम दिया जाता है। ऐसा करने के लिए, वे मसालेदार भोजन या शराब लेने की सलाह देते हैं, या एक उत्तेजक पदार्थ का इंजेक्शन, जैसे कि गोनोवाक्सिन या पाइरोजेनल, किया जाता है। इसके अलावा, के बीच का अंतराल जीवाणुरोधी दवाएंऔर विश्लेषण का वितरण कम से कम चौदह दिन का होना चाहिए।

परिणामों का मूल्यांकन करते समय, किसी को इस तथ्य को ध्यान में रखना चाहिए कि न केवल जीवित जीवाणुओं में, बल्कि मृत लोगों में भी, विशेष रूप से क्लैमाइडिया के लिए ल्यूमिनेसिसेंस मनाया जाता है। एंटीबायोटिक्स के एक कोर्स के बाद, मृत क्लैमाइडिया कोशिकाएं भी चमकती हैं।

रोगी की उचित तैयारी और स्मीयर लेने की तकनीक के पालन के साथ, यह विश्लेषण आपको प्रारंभिक अवस्था में रोगों की पहचान करने की अनुमति देता है, जो कि बहुत महत्वपूर्ण है समय पर इलाज. इस पद्धति के सकारात्मक पहलू परिणाम प्राप्त करने के लिए कम समय, कार्यान्वयन में आसानी और विश्लेषण की कम लागत हैं।

नुकसान में यह तथ्य शामिल है कि विश्लेषण के लिए अध्ययन के तहत पर्याप्त मात्रा में सामग्री की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, केवल एक अनुभवी विशेषज्ञ ही परिणामों का मूल्यांकन कर सकता है।

immunoblotting[अंग्रेजी से। ब्लॉट, स्पॉट] - उपयुक्त ज्ञात सीरा (या एजी) का उपयोग करके एजी (या एटी) की पहचान करने की एक विधि। व्यवहार में, उनका उपयोग एचआईवी एजी की पहचान करने के लिए किया जाता है। प्रारंभ में, वायरस एजी को पॉलीएक्रेलिक जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है (व्यवहार में, यह प्रक्रिया नहीं की जाती है, लेकिन एक वाणिज्यिक अभिकर्मक का उपयोग किया जाता है)। फिर एक वाहक (नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्म या सक्रिय कागज) अवक्षेप स्ट्रिप्स पर लगाया जाता है और वैद्युतकणसंचलन जारी रहता है। उसके बाद, रोगी के सीरम को फिल्म पर लगाया जाता है और इनक्यूबेट किया जाता है।

अनबाउंड एटी (यदि कोई हो) को धोने के बाद, एलिसा- मानव आईजी के खिलाफ एक एंजाइम-लेबल एंटीसेरम और एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट जो एंजाइम के साथ बातचीत करते समय रंग बदलता है, फिल्म पर लागू होता है। एजी-एटी-एंटीसेरम से एलजी तक परिसरों की उपस्थिति में, वाहक पर रंगीन धब्बे दिखाई देते हैं (चित्र 10-20)।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया (आरआईएफ)

इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया (रीफ) ए. कून्स (1941) द्वारा विकसित किया गया था और यह फ्लोरोक्रोम डाई के साथ लेबल किए गए एटी के उपयोग पर आधारित है। इस तरह के एंटीबॉडी, विभिन्न एंटीजन को बांधते हैं, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की यूवी किरणों में प्रतिरक्षा परिसरों को चमकने का कारण बनते हैं। व्यवहार में, कई विकल्प हैं रीफ.

वर्तमान में, सीरोलॉजिकल परीक्षण (एसआर) का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसमें लेबल किए गए एंटीजन या एंटीबॉडी शामिल होते हैं। इनमें इम्यूनोफ्लोरेसेंस, रेडियोइम्यूनोसे, एंजाइम इम्यूनोसे, इम्युनोब्लॉटिंग, फ्लो साइटोमेट्री और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल हैं।

वे लागू होते हैं:

1) सेरोडायग्नोसिस के लिए संक्रामक रोग, यानी, विभिन्न लेबल (एंजाइम, फ्लोरोक्रोम डाई) के साथ ज्ञात संयुग्मित (रासायनिक रूप से संयुक्त) एंटीजन के एक सेट का उपयोग करके एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए;

2) मानक लेबल वाले नैदानिक ​​एंटीबॉडी (तेजी से निदान) का उपयोग करके सूक्ष्मजीव या उसके सेरोवर का निर्धारण करना।

खाना बनाना नैदानिक ​​सीराउपयुक्त प्रतिजन के साथ जानवरों का टीकाकरण, फिर इम्युनोग्लोबुलिन को अलग किया जाता है और चमकदार रंगों (फ्लोरोक्रोमेस), एंजाइम, रेडियोआइसोटोप के साथ संयुग्मित किया जाता है।

डायग्नोस्टिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एक मायलोमा सेल के साथ एक प्रतिरक्षा बी-लिम्फोसाइट के संलयन द्वारा गठित हाइब्रिड कोशिकाओं का उपयोग करके प्राप्त की जाती हैं। हाइब्रिडोमा कोशिका संवर्धन में इन विट्रो में तेजी से गुणा करने में सक्षम होते हैं और लिए गए बी-लिम्फोसाइट की इम्युनोग्लोबुलिन विशेषता का उत्पादन करते हैं।

लेबल किए गए एसआर विशिष्टता में अन्य एसआर से कम नहीं हैं, और वे अपनी संवेदनशीलता में सभी एसआर से आगे निकल जाते हैं।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया (आरआईएफ)

ग्लोइंग फ्लोरोक्रोम डाई (फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट, आदि) का उपयोग एक लेबल के रूप में किया जाता है।

आरआईएफ के विभिन्न संशोधन हैं। एक्सप्रेस के लिए - संक्रामक रोगों का निदान - परीक्षण सामग्री में रोगाणुओं या उनके प्रतिजनों का पता लगाने के लिए, कून के अनुसार आरआईएफ का उपयोग किया जाता है।

कून के अनुसार आरआईएफ के दो तरीके हैं: प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष।

प्रत्यक्ष आरआईएफ घटक:

1) अध्ययन के तहत सामग्री (मल, नासोफरीनक्स का निर्वहन, आदि);

2) वांछित प्रतिजन के लिए एंटीबॉडी युक्त विशिष्ट प्रतिरक्षा सीरम लेबल;

3) आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान।

परीक्षण सामग्री से एक स्मीयर को लेबल एंटीसेरम से उपचारित किया जाता है।

एक एजी-एटी प्रतिक्रिया होती है। उस क्षेत्र में जहां एजी-एटी परिसरों को स्थानीयकृत किया जाता है, ल्यूमिनसेंट सूक्ष्म परीक्षा से लेबल के प्रतिदीप्ति का पता चलता है (चित्र। 34)।

अवयव अप्रत्यक्ष आरआईएफ, इन्फ्लूएंजा ए के एक्सप्रेस निदान के लिए अभिप्रेत है:

1) संदिग्ध इन्फ्लूएंजा वाले रोगी के नासॉफिरिन्क्स से परीक्षण सामग्री को धोना;

2) इन्फ्लूएंजा ए वायरस के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ विशिष्ट एंटीसेरम;

3) फ्लोरोक्रोम के साथ लेबल किए गए एंटीग्लोबुलिन सीरम (इम्युनोग्लोबुलिन के खिलाफ एटी);

4) आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड घोल।

परीक्षण सामग्री से एक स्मीयर को पहले प्रतिरक्षा सीरम के साथ वांछित एंटीजन के साथ इलाज किया जाता है, और फिर लेबल वाले एंटीग्लोबुलिन सीरम के साथ।

प्रतिरक्षी परिसरों AG-AT - लेबल AT का एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पता लगाया जाता है।

अप्रत्यक्ष विधि का लाभ यह है कि फ्लोरोसेंट विशिष्ट सीरा की एक विस्तृत श्रृंखला तैयार करने की कोई आवश्यकता नहीं है, और केवल एक फ्लोरोसेंट एंटीग्लोबुलिन सीरम का उपयोग किया जाता है।

के लिये इन्फ्लूएंजा ए का सीरोलॉजिकल निदान,यानी रक्त सीरम में इन्फ्लूएंजा ए वायरस के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए अप्रत्यक्ष आरआईएफइन्फ्लूएंजा डायग्नोस्टिकम (इन्फ्लुएंजा ए वायरस एंटीजन) का उपयोग करें। सेरोडायग्नोस्टिक्स विषाणु संक्रमणमुख्य रूप से पूर्वव्यापी है और इसका उपयोग निदान और महामारी विज्ञान विश्लेषण की पुष्टि के लिए किया जाता है।

एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा): प्रतिस्पर्धी विधि (हेपेटाइटिस बी वायरस के एचबी-एजी का निर्धारण) और अप्रत्यक्ष विधि (एचआईवी संक्रमण का सीरोलॉजिकल निदान)

एंजाइम इम्युनोसे (एलिसा)

एंजाइमों को एक लेबल के रूप में उपयोग किया जाता है: पेरोक्सीडेज, क्षारीय फॉस्फेट, आदि।

प्रतिक्रिया का संकेतक उपयुक्त सब्सट्रेट के संपर्क में आने पर एंजाइमों की रंग प्रतिक्रियाओं का कारण बनने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, पेरोक्सीडेज के लिए सब्सट्रेट ऑर्थोफेनिलडायमाइन (ओपीडी) या टेट्रामेथिलबेन्ज़िडाइन (टीएमबी) का एक समाधान है।

सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला ठोस-चरण एलिसा (चित्र। 35), अप्रत्यक्ष और प्रतिस्पर्धी तरीके (चित्र। 36)।

एलिसा के परिणामों का मूल्यांकन नेत्रहीन और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (एलिसा विश्लेषक) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापकर किया जा सकता है।

एलिसा के लाभों में शामिल हैं:

प्रतिक्रिया मूल्यांकन विधियों की सरलता;

संयुग्मों की स्थिरता;

स्वचालन के लिए आसानी से उत्तरदायी।

निम्नलिखित प्रकार के एलिसा उदाहरण के रूप में दिए गए हैं:

ए) प्रतिस्पर्धी प्रकार

निदान के दौरान रक्त सीरम और प्लाज्मा में हेपेटाइटिस बी वायरस (HBs Ag) के सतह प्रतिजन का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया वायरल हेपेटाइटिसबी और एचबी एजी की ढुलाई का निर्धारण।

अवयव:

1) परीक्षण सामग्री - सीरम या रक्त प्लाज्मा;

2) एचबी एजी के प्रति एंटीबॉडी एक पॉलीस्टाइनिन माइक्रोप्लेट के एक कुएं की सतह पर adsorbed;

3) संयुग्म - पेरोक्सीडेज के साथ लेबल किए गए एचबीएस एजी के लिए माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी;

4) ऑर्थोफेनिलेनेडियम (ओपीडी) - सब्सट्रेट;

5) फॉस्फेट-खारा बफर;

6) नियंत्रण सीरा:

सकारात्मक (एचबीएस एजी के साथ सीरम);

नकारात्मक (एचबीएस एजी के बिना सीरम)।

प्रगति:

2. ऊष्मायन 1 घंटा 37 डिग्री सेल्सियस पर।

3. कुओं की धुलाई।

4. संयुग्म का परिचय।

5. ऊष्मायन 1 घंटा 37 डिग्री सेल्सियस पर।

6. कुओं की धुलाई।

7. ओएफडी की शुरूआत। HBs Ag की उपस्थिति में, कुओं में विलयन पीला हो जाता है।

8. एलिसा के लिए लेखांकन एक फोटोमीटर का उपयोग करके ऑप्टिकल घनत्व द्वारा किया जाता है। ऑप्टिकल घनत्व की डिग्री जांचे गए HBs Ag की सांद्रता के व्युत्क्रमानुपाती होगी।

प्रतिक्रिया तीन चरणों में आगे बढ़ती है:

1. अध्ययन किए गए सीरम (प्लाज्मा) का HBs Ag, कुएं की सतह पर अधिशोषित समजातीय प्रतिरक्षी से बंध जाता है। आईआर एजी-एटी का गठन किया गया है। (HBs Ag - एंटी HBs AT)।

2. पेरोक्सीडेज के साथ लेबल किए गए HBs Ag के प्रतिपिंड एजी-एटी कॉम्प्लेक्स के शेष मुक्त HBs Ag निर्धारकों से बंधते हैं। एटी-एजी-लेबल एटी (एंटी एचबी एटी - एचबीएस एजी - एंटी एचबी एटी पेरोक्सीडेज के साथ लेबल) का एक कॉम्प्लेक्स बनता है।

3. ओपीडी एटी-एजी-एटी कॉम्प्लेक्स के पेरोक्सीडेज के साथ परस्पर क्रिया करता है और पीला धुंधलापन होता है।

बी) अप्रत्यक्ष प्रकार

यह एचआईवी संक्रमण के निदान के लिए मुख्य परीक्षण प्रतिक्रिया है।

उद्देश्य: एचआईवी संक्रमण का सीरोलॉजिकल निदान - एचआईवी प्रतिजनों के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाना।

अवयव:

1) परीक्षण सामग्री - रक्त सीरम (एबी से एजी-एम एचआईवी);

2) 2 एचआईवी प्रतिजनों की नकल करने वाले सिंथेटिक पेप्टाइड्स: जीपी 120 और जीपी 41, एक पॉलीस्टायर्न कुएं की सतह पर adsorbed;

3) मानव ग्लोब्युलिन (एटी से एटी) के साथ खरगोशों को प्रतिरक्षित करके प्राप्त पेरोक्सीडेज-लेबल एंटीग्लोबुलिन सीरम;

5) फॉस्फेट-बफर खारा;

6) नियंत्रण सीरा:

सकारात्मक;

नकारात्मक।

प्रगति:

1. नियंत्रण और परीक्षण सीरा का परिचय।

2. ऊष्मायन 30 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस पर।

3. लॉन्ड्रिंग।

4. एंजाइम-लेबल वाले एंटीग्लोबुलिन सीरम का परिचय।

5. ऊष्मायन 30 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस पर।

6. लॉन्ड्रिंग।

7. ओएफडी की शुरूआत।

प्रतिक्रिया 3 चरणों में आगे बढ़ती है:

1. अध्ययन किए गए सीरम के एचआईवी के लिए एंटीबॉडी समरूप प्रतिजनों (जीपी 120 और जीपी 41) से बंधते हैं, और आईआर एजी-एटी (एचआईवी एजी - एटी टू एचआईवी) शर्बत की सतह पर बनते हैं।

2. पेरोक्सीडेज के साथ लेबल किए गए आईसी एजी-एटी-एटी का गठन, चूंकि अध्ययन किए गए सीरम के एंटीबॉडी एंटीग्लोबुलिन सीरम के लिए एंटीजन हैं।

3. ओपीडी एजी-एटी-एटी कॉम्प्लेक्स के पेरोक्साइड के साथ इंटरैक्ट करता है, और अच्छी तरह से समाधान का पीला रंग होता है। डिग्री एंजाइमी गतिविधिअध्ययन किए गए एंटीबॉडी की एकाग्रता के लिए सीधे आनुपातिक है।

प्रतिक्रिया इस तथ्य पर आधारित है कि प्रतिरक्षा सीरा को फ्लोरोक्रोमेस (एफआईटीसी) के साथ इलाज किया जाता है, जो एंटीबॉडी के साथ संयुक्त होते हैं। सीरा अपनी प्रतिरक्षा विशिष्टता नहीं खोता है। जब परिणामी ल्यूमिनसेंट सीरम संबंधित एंटीजन के साथ इंटरैक्ट करता है, तो एक विशिष्ट ल्यूमिनस कॉम्प्लेक्स बनता है, जो एक ल्यूमिनसेंट माइक्रोस्कोप में आसानी से दिखाई देता है।

प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए विभिन्न इम्यूनोफ्लोरेसेंट सेरा का उपयोग किया जा सकता है। प्रत्यक्ष विधि में, रोगज़नक़ की मारे गए संस्कृति के साथ एक खरगोश को प्रतिरक्षित करके प्रत्येक सूक्ष्म जीव के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रतिरक्षा सीरा तैयार किया जाता है, फिर खरगोश प्रतिरक्षा सीरम को फ्लोरोक्रोम (फ्लोरेसिन आइसोसाइनेट या आइसोथियोसाइनेट) के साथ जोड़ा जाता है। बैक्टीरियल या वायरल एंटीजन का पता लगाने के लिए इस पद्धति का उपयोग एक्सप्रेस डायग्नोस्टिक्स के लिए किया जाता है।

अप्रत्यक्ष विधि में गैर-फ्लोरोसेंट डायग्नोस्टिक इम्यून सीरम (प्रतिरक्षित खरगोश या बीमार व्यक्ति) और डायग्नोस्टिक सीरम प्रजाति ग्लोब्युलिन के खिलाफ एंटीबॉडी युक्त फ्लोरोसेंट सीरम का उपयोग शामिल है।

नौकरी #3

एंजाइम इम्यूनोएसे (आईएफए)

एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। यह इस तथ्य पर आधारित है कि प्रोटीन प्लेटों पर दृढ़ता से अधिशोषित होते हैं, उदाहरण के लिए, पॉलीविनाइल क्लोराइड से। व्यवहार में सबसे आम एलिसा रूपों में से एक समान विशिष्टता के एंजाइम-लेबल विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग पर आधारित है। विश्लेषण किए गए एंटीजन के साथ एक समाधान को वाहक में स्थिर एंटीबॉडी के साथ जोड़ा जाता है। ऊष्मायन के दौरान, ठोस चरण पर विशिष्ट एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स बनते हैं। फिर, वाहक को अनबाउंड घटकों से धोया जाता है और एक एंजाइम के साथ लेबल किए गए समरूप एंटीबॉडी को जोड़ा जाता है, जो परिसरों में एंटीजन की मुक्त संयोजकता से बंधते हैं। एक दूसरे ऊष्मायन और इन एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी की अधिकता को हटाने के बाद, वाहक पर एंजाइमेटिक गतिविधि निर्धारित की जाती है, जिसका मूल्य अध्ययन के तहत एंटीजन की प्रारंभिक एकाग्रता के समानुपाती होगा।

एलिसा के एक अन्य प्रकार में, परीक्षण सीरम को स्थिर प्रतिजन में जोड़ा जाता है। एंजाइम-लेबल वाले एंटीग्लोबुलिन एंटीबॉडी का उपयोग करके अनबाउंड घटकों को ऊष्मायन और हटाने के बाद, विशिष्ट इम्युनोकोम्पलेक्स का पता लगाया जाता है। यह योजना एलिसा की सेटिंग में सबसे आम में से एक है।

विशिष्ट परीक्षण सामग्री- विशिष्ट एंटीबॉडी सब्सट्रेट

पेरोक्सीडेज के लिए पेरोक्सीडेज के साथ एंटीबॉडी रोगज़नक़

जांच की गई एजीएस, लेबल

सीरम पेरोक्साइडस सब्सट्रेट के लिए

विशिष्ट पेरोक्साइड

नियंत्रण:

सकारात्मक - पेरोक्सीडेज + सब्सट्रेट के साथ लेबल किया गया प्रतिरक्षा सीरम - 2 कुएं;

नकारात्मक - सामान्य सीरम + सब्सट्रेट - 2 कुएं।

आरआईएफ (कून्स प्रतिक्रिया) स्थापित करने के लिए दो विकल्प हैं - प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रियाएं।

डायरेक्ट आरआईएफ एक सरल एक-चरणीय प्रतिक्रिया है, लेकिन चूंकि इसके लिए बड़ी मात्रा में की आवश्यकता होती है

लेबल किए गए रोगाणुरोधी सीरा, तो यह कम अक्सर अप्रत्यक्ष होता है, जिसका उत्पादन एक लेबल वाले एंटीसेरम द्वारा प्रदान किया जाता है।

अप्रत्यक्ष आरआईएफ एक दो चरण की प्रतिक्रिया है जिसमें एंटीजन पहले गैर-लेबल प्रजातियों के सीरम से बंधे होते हैं, और फिर एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिरक्षा परिसर का गठन एफआईटीसी-लेबल वाले एंटीसेरम के साथ किया जाता है जिसमें इस परिसर के इम्युनोग्लोबुलिन के खिलाफ एंटीबॉडी होते हैं। आमतौर पर, इसके निर्माण के चरण I में, संबंधित सूक्ष्मजीव के साथ जानवरों को प्रतिरक्षित करके प्राप्त प्रतिरक्षा खरगोश सीरम का उपयोग एक प्रजाति सीरम के रूप में किया जाता है, और चरण II में, खरगोश गामा ग्लोब्युलिन के साथ प्रतिरक्षित गधों या अन्य जानवरों के FITC-लेबल विरोधी खरगोश सीरम ( अंजीर। 9)।

प्रत्यक्ष आरआईएफ सेटिंग। एक वसा रहित कांच की स्लाइड पर, परीक्षण सामग्री से पतले स्मीयर बनाए जाते हैं, और स्मीयर-छाप अंगों और ऊतकों से बनाए जाते हैं। तैयारियों को सुखाया जाता है, स्थिर किया जाता है, काम करने वाले कमजोर पड़ने में लिया गया ल्यूमिनसेंट सीरम उन पर लगाया जाता है, और 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 20-30 मिनट (25-40 मिनट के लिए - कमरे के तापमान पर) के लिए एक नम कक्ष में रखा जाता है। फिर, अतिरिक्त फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को हटाने के लिए, तैयारी को 10-15 मिनट के लिए बफर्ड आइसोटोनिक सोडियम क्लोराइड समाधान में धोया जाता है, इसके बाद आसुत या बहते पानी में 10 मिनट के लिए कुल्ला किया जाता है। कमरे के तापमान पर सुखाएं और एक तेल विसर्जन प्रणाली का उपयोग करके एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें।

जीवाणु कोशिकाओं के विशिष्ट प्रतिदीप्ति की तीव्रता का आकलन करने के लिए, चार-प्लस पैमाने का उपयोग किया जाता है: "++++", "++++" - बहुत उज्ज्वल और उज्ज्वल; "++", "+" - कोशिकाओं का स्पष्ट और कमजोर कॉलोनिक हरा प्रतिदीप्ति। तीन नियंत्रण अनिवार्य हैं: 1) समरूप बैक्टीरिया (सकारात्मक नियंत्रण) के फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ उपचार; 2) विषम संस्कृति (नकारात्मक नियंत्रण); 3) असंक्रमित सामग्री (नकारात्मक नियंत्रण)।

पूरक आरआईएफ। प्रतिक्रिया सीएससी का एक संशोधन है, जिसमें एफआईटीसी के साथ लेबल किए गए पूरक एंटीबॉडी एक संकेतक प्रणाली (छवि 10) के रूप में काम करते हैं।

अप्रत्यक्ष विरोधी पूरक आरआईएफ निम्नानुसार स्थापित किया गया है: आरआईएफ के लिए एक ग्लास स्लाइड पर एंटीजन तैयारी तैयार की जाती है, लेकिन चरण I में इसे एक प्रतिरक्षा सीरम के साथ नहीं, बल्कि गिनी पिग पूरक के साथ इसके मिश्रण के साथ संसाधित किया जाता है, और चरण में II पूरक करने के लिए FITC-लेबल एंटीबॉडी युक्त एक एंटीसेरम के साथ। पूरक पूरक आरआईएफ का व्यापक उपयोग विरोधी पूरक एंटीबॉडी प्राप्त करने की कठिनाई और जिस तरह से उन्हें "लेबल" किया जाता है, द्वारा सीमित है।