ما هي الشعاب المرجانية في الطب. تفاعل التألق المناعي (الشعاب المرجانية). التحضير لهذا الإجراء

اختبار التألق المناعي (IF) هو اختبار مصلي يكتشف الأجسام المضادة لمولدات المضادات المعروفة. تتكون الطريقة في الفحص المجهري للمسحات الملطخة.

يستخدم هذا التفاعل في علم المناعة وعلم الفيروسات وعلم الأحياء الدقيقة. يسمح لك بتحديد وجود الفيروسات والبكتيريا والفطريات والأوليات و ICC. يستخدم RIF على نطاق واسع في الممارسة التشخيصية للكشف عن المستضدات الفيروسية والبكتيرية في المواد المعدية. تعتمد الطريقة على قدرة الفلوروكروم على الارتباط بالبروتينات دون انتهاك خصوصياتها المناعية. يستخدم بشكل رئيسي في تشخيص التهابات المسالك البولية.

هناك الطرق التالية لتنفيذ تفاعل التألق المناعي: مباشر ، غير مباشر ، مع مكمل. تتمثل الطريقة المباشرة في تلطيخ المادة بالكروم الفلوري. نظرًا لقدرة مستضدات الميكروبات أو الأنسجة على التوهج في الأشعة فوق البنفسجية لمجهر الفلورسنت ، يتم تعريفها على أنها خلايا ذات حدود خضراء زاهية الألوان.

تتكون الطريقة غير المباشرة في تحديد معقد المستضد + الجسم المضاد. للقيام بذلك ، يتم معالجة المادة التجريبية بأجسام مضادة من مصل الأرانب المضاد للميكروبات المعدة للتشخيص. بعد أن ترتبط الأجسام المضادة بالميكروبات ، يتم فصلها عن تلك غير المقيدة ومعالجتها بمصل مضاد للأرانب المسمى بالفلوروكروم. بعد ذلك ، يتم تحديد الميكروب المعقد + الأجسام المضادة للميكروبات + الأجسام المضادة للأرانب باستخدام مجهر الأشعة فوق البنفسجية بنفس الطريقة كما في الطريقة المباشرة.

لا غنى عن تفاعل التألق المناعي في تشخيص مرض الزهري. تحت تأثير الفلوروكروم ، يتم تحديد العامل المسبب لمرض الزهري كخلية ذات حدود صفراء وخضراء. عدم وجود توهج يعني أن المريض غير مصاب بمرض الزهري. غالبًا ما يوصف هذا التحليل بتفاعل واسرمان الإيجابي. هذه الطريقة فعالة جدًا في التشخيص ، حيث تسمح لك بتحديد العوامل الممرضة المراحل الأولىالأمراض.

بالإضافة إلى حقيقة أن RIF يسمح لك بتشخيص مرض الزهري ، فإنه يستخدم أيضًا لتحديد وجود مسببات الأمراض مثل الكلاميديا ​​والميكوبلازما والتريكوموناس ومسببات مرض السيلان والهربس التناسلي.

للتحليل ، يتم استخدام المسحات أو الدم الوريدي. إجراء أخذ اللطاخة غير مؤلم تمامًا ولا يشكل أي خطر. استعد لهذا التحليل. قبل 12 ساعة من ذلك ، لا ينصح باستخدام منتجات النظافة ، مثل القليل أو المواد الهلامية. أيضًا ، في بعض الأحيان ، وفقًا لشهادة الطبيب ، يتم إجراء استفزاز. للقيام بذلك ، يوصون بتناول الطعام الحار أو الكحول ، أو إجراء حقنة من مادة استفزازية ، مثل لقاح الغونوفاكين أو الحمى. بالإضافة إلى ذلك ، الفاصل الزمني بين الأدوية المضادة للبكتيرياويجب أن يكون تسليم التحليل أربعة عشر يومًا على الأقل.

عند تقييم النتائج ، ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار حقيقة أن اللمعان لا يُلاحظ فقط في البكتيريا الحية ، ولكن أيضًا في البكتيريا الميتة ، خاصة بالنسبة للكلاميديا. بعد تناول المضادات الحيوية ، تتوهج أيضًا خلايا الكلاميديا ​​الميتة.

مع الإعداد المناسب للمريض ومراعاة أسلوب أخذ اللطاخة ، يتيح لك هذا التحليل التعرف على الأمراض في المراحل المبكرة ، وهو أمر مهم جدًا بالنسبة العلاج في الوقت المناسب. الجوانب الإيجابية لهذه الطريقة هي قصر الوقت للحصول على النتيجة ، وسهولة التنفيذ وانخفاض تكلفة التحليل.

تشمل العيوب حقيقة أن كمية كبيرة بما فيه الكفاية من المواد قيد الدراسة مطلوبة للتحليل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن فقط للأخصائي المتمرس تقييم النتائج.

مناعي[من الانجليزية. لطخة ، بقعة] - طريقة لتحديد Ag (أو AT) باستخدام الأمصال المعروفة المناسبة (أو Ag). في الممارسة العملية ، يتم استخدامها لتحديد فيروس HIV Ag. في البداية ، يتم عزل الفيروس Ag عن طريق الرحلان الكهربائي في هلام بولي أكريليك (في الممارسة العملية ، لا يتم تنفيذ هذا الإجراء ، ولكن يتم استخدام كاشف تجاري). ثم يتم تطبيق مادة حاملة (فيلم نيتروسليلوز أو ورق منشط) على شرائط الترسيب ويستمر الرحلان الكهربي. بعد ذلك ، يتم وضع مصل المريض على الفيلم وحضنه.

بعد الغسل غير منضم AT (إن وجد) ، إليسا- يتم تطبيق مصل مضاد للإنزيم ضد Ig البشري وركيزة كروموجينية يتغير لونها عند التفاعل مع الإنزيم على الفيلم. في وجود مجمعات Ag-AT-antiserum إلى lg ، تظهر بقع ملونة على الناقل (الشكل 10-20).

تفاعل التألق المناعي (RIF)

تفاعل التألق المناعي (الشعاب المرجانية) تم تطويره بواسطة A. Koons (1941) وهو يعتمد على استخدام AT المسمى بأصباغ الفلوروكروم. هذه الأجسام المضادة ، التي تربط مستضدات مختلفة ، تتسبب في توهج المجمعات المناعية في الأشعة فوق البنفسجية لمجهر الفلورسنت. في الممارسة العملية ، هناك عدة خيارات الشعاب المرجانية.

حاليًا ، تُستخدم الاختبارات المصلية (SR) على نطاق واسع ، حيث تشارك المستضدات أو الأجسام المضادة الموصوفة. وتشمل هذه التألق المناعي ، والمقايسة المناعية الإشعاعية ، والمقايسة المناعية للإنزيم ، والتكتل المناعي ، وقياس التدفق الخلوي ، والفحص المجهري الإلكتروني.

يطبقون:

1) للتشخيص المصلي أمراض معدية، على سبيل المثال ، لاكتشاف الأجسام المضادة باستخدام مجموعة من المستضدات المقترنة (المركبة كيميائيًا) المعروفة مع تسميات مختلفة (الإنزيمات ، أصباغ الفلوروكروم) ؛

2) لتحديد الكائن الدقيق أو مصله باستخدام الأجسام المضادة التشخيصية المعيارية الموصوفة (التشخيص السريع).

طبخ مصل التشخيصتحصين الحيوانات بالمستضد المناسب ، ثم يتم عزل الغلوبولين المناعي ودمجها مع الأصباغ المضيئة (الفلوروكرومات) والإنزيمات والنظائر المشعة.

يتم الحصول على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التشخيصية باستخدام خلايا هجينة تكونت عن طريق اندماج الخلايا الليمفاوية البائية المناعية مع خلية المايلوما. الأورام الهجينة قادرة على التكاثر بسرعة في المختبر في زراعة الخلايا وإنتاج الغلوبولين المناعي المميز للخلايا اللمفاوية البائية المأخوذة.

لا تعتبر SRs المصنفة أدنى من SRs الأخرى من حيث الخصوصية ، وتتفوق على جميع SRs في حساسيتها.

تفاعل التألق المناعي (RIF)

تستخدم أصباغ الفلوروكروم المتوهجة (الفلوريسين أيزوثيوسيانات ، إلخ) كملصق.

هناك العديد من التعديلات على RIF. للتشخيص السريع للأمراض المعدية - للكشف عن الميكروبات أو مستضداتها في مادة الاختبار ، يتم استخدام RIF وفقًا لـ Koons.

هناك طريقتان لـ RIF وفقًا لـ Koons: مباشر وغير مباشر.

مكونات RIF المباشرة:

1) المادة قيد الدراسة (البراز ، إفرازات البلعوم الأنفي ، إلخ) ؛

2) مصل مناعي محدد يحتوي على أجسام مضادة للمستضد المطلوب ؛

3) محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر.

يتم معالجة اللطاخة من مادة الاختبار بمصل مضاد معنون.

يحدث تفاعل AG-AT. يكشف الفحص المجهري الإنارة في المنطقة التي يتم فيها توطين مجمعات AG-AT عن تألق الملصق (الشكل 34).

عناصر RIF غير المباشر ، مخصص للتشخيص السريع للأنفلونزا أ:

1) مادة الاختبار تغسل من البلعوم الأنفي لمريض يشتبه في إصابته بالأنفلونزا ؛

2) مصل نوعي مع أجسام مضادة ضد فيروس الأنفلونزا أ ؛

3) مصل مضاد الغلوبولين (AT ضد الغلوبولين المناعي) المسمى بالفلوروكروم ؛

4) محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر.

يتم معالجة اللطاخة من مادة الاختبار أولاً بمصل مناعي للمستضد المطلوب ، ثم بمصل مضاد الغلوبولين المسمى.

تم الكشف عن المجمعات المناعية AG-AT - المسمى AT باستخدام مجهر الفلورسنت.

ميزة الطريقة غير المباشرة هي أنه لا توجد حاجة لتحضير مجموعة واسعة من الأمصال الفلورية المحددة ، ويستخدم فقط مصل مضاد للجلوبيولين الفلوري.

إلى عن على التشخيص المصلي للأنفلونزا أ ،أي للكشف عن الأجسام المضادة ضد فيروس الأنفلونزا أ في مصل الدم باستخدام RIF غير المباشراستخدام تشخيص الأنفلونزا (مستضد فيروس الأنفلونزا أ). التشخيص المصلي اصابات فيروسيةبأثر رجعي بشكل أساسي ويستخدم لتأكيد التشخيص والتحليل الوبائي.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA): طريقة تنافسية (تحديد HBs-AG لفيروس التهاب الكبد B) والطريقة غير المباشرة (التشخيص المصلي لعدوى فيروس العوز المناعي البشري)

المقايسة المناعية الإنزيمية (ELISA)

تستخدم الإنزيمات كتسمية: بيروكسيداز ، فوسفاتيز قلوي ، إلخ.

مؤشر التفاعل هو قدرة الإنزيمات على إحداث تفاعلات لونية عند تعرضها للركيزة المناسبة. على سبيل المثال ، ركيزة البيروكسيديز هي محلول أورثوفينيلديامين (OPD) أو رباعي ميثيل بنزيدين (TMB).

أكثر أنواع ELISA الصلبة استخدامًا على نطاق واسع (الشكل 35) ، والطرق غير المباشرة والتنافسية (الشكل 36).

يمكن تقييم نتائج ELISA بصريًا وقياس الكثافة الضوئية على مقياس الطيف الضوئي (محلل ELISA).

تشمل فوائد ELISA ما يلي:

بساطة أساليب تقييم الاستجابة ؛

استقرار الاتحادات

قابل للتشغيل الآلي بسهولة.

يتم إعطاء الأنواع التالية من ELISA كأمثلة:

أ) النوع التنافسي

مصمم لاكتشاف المستضد السطحي لفيروس التهاب الكبد B (HBs Ag) في مصل الدم والبلازما أثناء التشخيص التهاب الكبد الفيروسيب وتحديد نقل HBs Ag.

عناصر:

1) مادة الاختبار - مصل الدم أو بلازما الدم ؛

2) امتزاز الأجسام المضادة لـ HBs Ag على سطح بئر من صفيحة ميكروية من البوليسترين ؛

3) متقارن - الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر لـ HBs Ag المسمى بالبيروكسيداز ؛

4) orthophenylenediamine (OPD) - الركيزة ؛

5) عازلة الفوسفات المالحة ؛

6) مصل التحكم:

إيجابي (مصل مع HBs Ag) ؛

سلبي (مصل بدون HBs Ag).

تقدم:

2. فترة الحضانة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.

3. غسل الآبار.

4. إدخال المرافق.

5. فترة الحضانة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.

6. غسل الآبار.

7. إدخال OFD. في وجود HBs Ag ، يتحول المحلول الموجود في الآبار إلى اللون الأصفر.

8. يتم حساب ELISA عن طريق الكثافة الضوئية باستخدام مقياس الضوء. ستكون درجة الكثافة الضوئية متناسبة عكسيًا مع تركيز HBs Ag الذي تم فحصه.

يستمر التفاعل على ثلاث مراحل:

1. يرتبط HBs Ag من المصل المدروس (البلازما) بالأجسام المضادة المتماثلة الممتصة على سطح البئر. تم تشكيل IR AG-AT. (HBs Ag - anti HBs AT).

2. الأجسام المضادة لـ HBs Ag المسمى ببيروكسيداز ترتبط بمحددات HBs Ag الحرة المتبقية لمركب AG-AT. يتكون مركب AT-AG المسمى AT (مضاد HBs AT - HBs Ag - مضاد HBs AT المسمى بالبيروكسيداز).

3. تتفاعل العيادات الخارجية مع بيروكسيداز مركب AT-AG-AT ويحدث تلطيخ أصفر.

ب) النوع غير المباشر

إنه رد الفعل الرئيسي للاختبار لتشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.

الغرض: التشخيص المصلي لعدوى فيروس العوز المناعي البشري - الكشف عن الأجسام المضادة لمستضدات فيروس العوز المناعي البشري.

عناصر:

1) مادة الاختبار - مصل الدم (AB إلى AG-m HIV) ؛

2) الببتيدات الاصطناعية التي تحاكي مستضدين لفيروس نقص المناعة البشرية: gp 120 و gp 41 ، ممتزان على سطح بئر البوليسترين ؛

3) مصل مضاد للجلوبيولين المسمى البيروكسيديز تم الحصول عليه عن طريق تحصين الأرانب بالجلوبيولين البشري (AT إلى AT) ؛

5) محلول ملحي مخزّن بالفوسفات ؛

6) مصل التحكم:

إيجابي؛

سلبي.

تقدم:

1. إدخال مصل التحكم والاختبار.

2. فترة الحضانة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

3. غسيل الأموال.

4. إدخال مصل مضاد للجلوبيولين المسمى بالإنزيم.

5. فترة الحضانة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

6. غسيل الأموال.

7. إدخال OFD.

يستمر التفاعل في 3 مراحل:

1. ترتبط الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في المصل المدروس بمستضدات متماثلة (gp 120 و gp 41) ، وتتشكل IR AG-AT (HIV AG - AT to HIV) على سطح المادة الماصة.

2. تشكيل IC AG-AT-AT المسمى بالبيروكسيداز ، منذ ذلك الحين الأجسام المضادة للمصل المدروس هي مستضدات مصل مضاد الجلوبيولين.

3. يتفاعل OPD مع بيروكسيداز مركب AG-AT-AT ، ويحدث تلوين أصفر لمحلول البئر. درجة النشاط الأنزيمييتناسب طرديا مع تركيز الأجسام المضادة المدروسة.

يعتمد التفاعل على حقيقة أن الأمصال المناعية تعالج بالفلوروكرومات (FITC) ، والتي يتم دمجها مع الأجسام المضادة. الأمصال لا تفقد خصوصياتها المناعية. عندما يتفاعل مصل الإنارة الناتج مع المستضد المقابل ، يتم تكوين مركب مضيء محدد ، والذي يمكن رؤيته بسهولة في مجهر الإنارة.

يمكن استخدام الأمصال المناعية المختلفة للتألق المناعي المباشر وغير المباشر. في الطريقة المباشرة ، يتم تحضير الأمصال المناعية الفلورية المحددة لكل ميكروب عن طريق تحصين أرنب بثقافة مقتولة من العامل الممرض ، ثم يتم دمج مصل المناعة للأرنب مع الفلوروكروم (أيزوسيانات الفلورسين أو إيزوثيوسيانات). تستخدم الطريقة للتشخيص السريع من أجل الكشف عن المستضدات البكتيرية أو الفيروسية.

تتضمن الطريقة غير المباشرة استخدام مصل مناعي تشخيصي غير الفلوريسنت (أرنب محصن أو شخص مريض) ومصل يحتوي على أجسام مضادة للجلوبيولين لأنواع مصل التشخيص.

الوظيفة رقم 3

المقايسة المناعية الإنزيمية (IFA)

يستخدم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) على نطاق واسع. يعتمد على حقيقة أن البروتينات يتم امتصاصها بقوة على الألواح ، على سبيل المثال ، من كلوريد البوليفينيل. يعتمد أحد أكثر متغيرات ELISA شيوعًا في الممارسة على استخدام الأجسام المضادة المحددة التي تحمل علامات الإنزيم والتي لها نفس الخصوصية. يضاف محلول مع المستضد الذي تم تحليله إلى الناقل بأجسام مضادة ثابتة. أثناء الحضانة ، تتشكل معقدات محددة من الجسم المضاد للمستضد على الطور الصلب. بعد ذلك ، يتم غسل المادة الحاملة من المكونات غير المقيدة ويتم إضافة الأجسام المضادة المتماثلة الموصوفة بإنزيم ، والتي ترتبط بالتكافؤات الحرة للمستضد في المجمعات. بعد الحضانة الثانية وإزالة الفائض من هذه الأجسام المضادة المسمى بالإنزيم ، يتم تحديد النشاط الأنزيمي على الناقل ، وتكون قيمته متناسبة مع التركيز الأولي للمستضد قيد الدراسة.

في نوع آخر من ELISA ، يضاف مصل الاختبار إلى المستضد المعطل. بعد الحضانة وإزالة المكونات غير المقيدة باستخدام الأجسام المضادة التي تحمل علامات الإنزيم ، يتم الكشف عن مركبات مناعية محددة. هذا المخطط هو الأكثر شيوعًا في إعداد ELISA.

مادة اختبار محددة - ركيزة جسم مضاد محدد

ممرض الأجسام المضادة مع بيروكسيداز للبيروكسيديز

AGS التحقيق ، المسمى

الركيزة بيروكسيداز المصل ل

بيروكسيداز محدد

مراقبة:

إيجابي - مصل مناعي معنون بالبيروكسيديز + الركيزة - بئرين ؛

سلبي - مصل طبيعي + ركيزة - بئرين.

هناك خياران لضبط RIF (تفاعل Coons) - تفاعلات التألق المناعي المباشرة وغير المباشرة.

إن Direct RIF هو رد فعل بسيط من خطوة واحدة ، ولكنه يتطلب كمية كبيرة من

الأمصال المضادة للميكروبات المسمى ، فإنه غالبًا ما يكون غير مباشر ، ويتم توفير إنتاجه بواسطة مصل مضاد واحد.

RIF غير المباشر عبارة عن تفاعل من مرحلتين يتم فيه ربط المستضد أولاً بمصل الأنواع غير المصنفة ، ثم يتم التعامل مع المركب المناعي للجسم المضاد المسمى بـ FITC الذي يحتوي على أجسام مضادة ضد الغلوبولين المناعي لهذا المركب. عادة ، في المرحلة الأولى من صياغته ، يتم استخدام مصل الأرانب المناعي الذي تم الحصول عليه عن طريق تحصين الحيوانات بالكائنات الحية الدقيقة المقابلة كمصل للأنواع ، وفي المرحلة الثانية ، مصل مضاد للأرانب يحمل علامة FITC للحمير أو الحيوانات الأخرى المحصنة مع الأرانب جاما جلوبيولين ( الشكل 9).

إعداد RIF المباشر. على شريحة زجاجية خالية من الدهون ، تُصنع مسحات رقيقة من مادة الاختبار ، وتصنع بصمات المسحات من الأعضاء والأنسجة. المستحضرات مجففة ، ثابتة ، مصل مضيء يؤخذ في تخفيف العمل ، ويوضع في غرفة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة (لمدة 25-40 دقيقة - في درجة حرارة الغرفة). بعد ذلك ، لإزالة الأجسام المضادة الفلورية الزائدة ، يتم غسل المستحضر في محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر لمدة 10-15 دقيقة ، يليه الشطف بالماء المقطر أو الجاري لمدة 10 دقائق. تجف في درجة حرارة الغرفة وفحصها تحت مجهر الفلورسنت باستخدام نظام الغمر بالزيت.

لتقييم شدة التألق المحدد للخلايا البكتيرية ، يتم استخدام مقياس أربعة زائد: "++++" ، "+++" - مشرق للغاية ومشرق ؛ "++" ، "+" - وضوحا وضعف القولون الأخضر مضان للخلايا. ثلاثة ضوابط إلزامية: 1) العلاج بالأجسام المضادة الفلورية للبكتيريا المتماثلة (التحكم الإيجابي) ؛ 2) ثقافة غير متجانسة (تحكم سلبي) ؛ 3) مادة غير مصابة (تحكم سلبي).

RIF المضاد التكميلي. التفاعل عبارة عن تعديل لـ CSC ، حيث تعمل الأجسام المضادة التكميلية الموصوفة بـ FITC كنظام مؤشر (الشكل 10).

يتم إعداد RIF غير المباشر والمضاد التكميلي على النحو التالي: يتم تحضير المستضد على شريحة زجاجية ، كما هو الحال بالنسبة لـ RIF ، ولكن في المرحلة الأولى لا تتم معالجته بمصل مناعي واحد ، ولكن بمزجه مع مكمل خنزير غينيا ، وفي المرحلة II مع مضاد يحتوي على أجسام مضادة تحمل علامة FITC لتكملها. الاستخدام الواسع النطاق لـ RIF المضاد التكميلي محدود بسبب صعوبة الحصول على الأجسام المضادة التكميلية والطريقة "المسمى" بها.