Mikä on riutta lääketieteessä. Immuunifluoresenssireaktio (riutta). Valmistautuminen menettelyyn

Immunofluoresenssitesti (IF) on serologinen testi, joka havaitsee vasta-aineita tunnetuille antigeeneille. Menetelmä koostuu värjäytyneiden sivelynäytteiden mikroskopiasta.

Tätä reaktiota käytetään immunologiassa, virologiassa ja mikrobiologiassa. Sen avulla voit määrittää virusten, bakteerien, sienten, alkueläinten ja ICC:n läsnäolon. RIF:ää käytetään erittäin laajasti diagnostisessa käytännössä virus- ja bakteeriantigeenien havaitsemiseen tartuntamateriaalista. Menetelmä perustuu fluorokromin kykyyn sitoutua proteiineihin rikkomatta niiden immunologista spesifisyyttä. Sitä käytetään pääasiassa virtsatieinfektioiden diagnosointiin.

On olemassa seuraavat menetelmät immunofluoresenssireaktion suorittamiseksi: suora, epäsuora, komplementin kanssa. Suora menetelmä koostuu materiaalin värjäyksestä fluorokromeilla. Mikrobien tai kudosten antigeenien kyvystä hehkua fluoresoivan mikroskoopin UV-säteissä, ne määritellään soluiksi, joissa on kirkkaanvärinen vihreä reuna.

Epäsuora menetelmä koostuu antigeeni+vasta-ainekompleksin määrittämisestä. Tätä varten koemateriaali käsitellään diagnostiikkaan tarkoitetun antimikrobisen kanin seerumin vasta-aineilla. Kun vasta-aineet ovat sitoutuneet mikrobeihin, ne erotetaan sitoutumattomista ja käsitellään fluorokromilla leimatulla anti-kanin seerumilla. Tämän jälkeen kompleksimikrobi+animimikrobivasta-aineet+kanin vasta-aineet määritetään ultraviolettimikroskoopilla samalla tavalla kuin suorassa menetelmässä.

Immunofluoresenssireaktio on välttämätön kupan diagnosoinnissa. Fluorokromin vaikutuksesta kupan aiheuttaja määritetään soluksi, jossa on kelta-vihreä reuna. Hehkun puuttuminen tarkoittaa, että potilaalla ei ole kuppatartuntaa. Tämä analyysi määrätään usein positiivisella Wasserman-reaktiolla. Tämä menetelmä on erittäin tehokas diagnoosissa, koska sen avulla voit tunnistaa patogeenin alkuvaiheessa sairaudet.

Sen lisäksi, että RIF mahdollistaa kupan diagnosoinnin, sitä käytetään myös patogeenien, kuten klamydian, mykoplasman, Trichomonasin, sekä gonorrhean ja genitaaliherpeksen patogeenien määrittämiseen.

Analyyseihin käytetään sivelyä tai laskimoverta. Kokeilunäytteenotto on täysin kivuton eikä aiheuta vaaraa. Valmistaudu tähän analyysiin. Kaksitoista tuntia ennen sitä ei ole suositeltavaa käyttää hygieniatuotteita, kuten vähän tai geelejä. Joskus lääkärin todistuksen mukaan suoritetaan myös provokaatio. Tätä varten he suosittelevat mausteisen ruoan tai alkoholin ottamista tai provosoivan aineen, kuten gonovaccinin tai pyrogenalin, injektiota. Lisäksi väli antibakteeriset lääkkeet ja analyysin toimituksen on oltava vähintään neljätoista päivää.

Tuloksia arvioitaessa tulee ottaa huomioon, että luminesenssia havaitaan paitsi elävissä bakteereissa myös kuolleissa, erityisesti klamydiassa. Antibioottikuurin jälkeen myös kuolleet klamydiasolut hehkuvat.

Kun potilas valmistellaan asianmukaisesti ja näytteenottotekniikkaa noudatetaan, tämän analyysin avulla voit tunnistaa sairaudet varhaisessa vaiheessa, mikä on erittäin tärkeää oikea-aikainen hoito. Tämän menetelmän positiivisia puolia ovat lyhyt aika tuloksen saamiseen, helppokäyttöisyys ja alhaiset analyysikustannukset.

Haittoja ovat se, että analyysiin tarvitaan riittävän suuri määrä tutkittavaa materiaalia. Lisäksi vain kokenut asiantuntija voi arvioida tuloksia.

Immunoblottaus[englannista. blot, spot] - menetelmä Ag:n (tai AT:n) tunnistamiseksi käyttämällä sopivia tunnettuja seerumeita (tai Ag:tä). Käytännössä niitä käytetään HIV Ag:n tunnistamiseen. Aluksi virus Ag eristetään elektroforeesilla polyakryyligeelissä (käytännössä tätä menettelyä ei suoriteta, vaan käytetään kaupallista reagenssia). Sitten saostumaliuskoille levitetään kantajaa (nitroselluloosakalvoa tai aktivoitua paperia) ja elektroforeesia jatketaan. Sen jälkeen potilaan seerumi levitetään kalvolle ja inkuboidaan.

Sitoutumattoman AT:n pesun jälkeen (jos on), ELISA- kalvolle levitetään entsyymileimattu antiseerumi ihmisen Ig:tä vastaan ​​ja kromogeeninen substraatti, joka muuttaa väriä vuorovaikutuksessa entsyymin kanssa. Ag-AT-antiseerumin ja lg:n kompleksien läsnä ollessa kantajalle ilmestyy värillisiä täpliä (kuviot 10-20).

Immunofluoresenssireaktio (RIF)

Immunofluoresenssireaktio (RIUTTA) on kehittänyt A. Koons (1941), ja se perustuu fluorokromiväreillä leimatun AT:n käyttöön. Tällaiset vasta-aineet, jotka sitovat erilaisia ​​antigeenejä, saavat immuunikompleksit hehkumaan fluoresoivan mikroskoopin UV-säteissä. Käytännössä vaihtoehtoja on useita RIUTTA.

Tällä hetkellä käytetään laajasti serologisia testejä (SR), joissa on mukana leimattuja antigeenejä tai vasta-aineita. Näitä ovat immunofluoresenssi, radioimmunomääritys, entsyymi-immunomääritys, immunoblottaus, virtaussytometria ja elektronimikroskopia.

Ne koskevat:

1) serodiagnoosia varten tarttuvat taudit ts. vasta-aineiden havaitsemiseksi käyttämällä sarjaa tunnettuja konjugoituja (kemiallisesti yhdistettyjä) antigeenejä, joissa on erilaisia ​​leimoja (entsyymit, fluorokromivärit);

2) mikro-organismin tai sen serovarian määrittäminen käyttäen standardileimattuja diagnostisia vasta-aineita (pikadiagnostiikka).

Ruoanlaitto diagnostiset seerumit Eläimet immunisoidaan sopivalla antigeenillä, sitten immunoglobuliinit eristetään ja konjugoidaan valoväreillä (fluorokromeilla), entsyymeillä ja radioisotoopeilla.

Diagnostisia monoklonaalisia vasta-aineita saadaan käyttämällä hybridisoluja, jotka on muodostettu fuusioimalla immuuni-B-lymfosyytti myeloomasolun kanssa. Hybridoomit pystyvät lisääntymään nopeasti in vitro soluviljelmässä ja tuottamaan otetulle B-lymfosyytille ominaista immunoglobuliinia.

Leimatut SR:t eivät ole huonompia kuin muut SR:t spesifisyydessään, ja ne ylittävät kaikki SR:t herkkyydeltään.

Immunofluoresenssireaktio (RIF)

Leimana käytetään hehkuvia fluorokromivärejä (fluoreseiini-isotiosyanaatti jne.).

RIF:iin on useita muunnelmia. Ekspressointiin - tartuntatautien diagnosointiin - mikrobien tai niiden antigeenien havaitsemiseen testimateriaalissa käytetään Koonsin mukaista RIF-testiä.

Koonsin mukaan RIF-menetelmää on kaksi: suora ja epäsuora.

Suorat RIF-komponentit:

1) tutkittava materiaali (jakkara, nenänielun erittyminen jne.);

2) leimattu spesifinen immuuniseerumi, joka sisältää vasta-aineita halutulle antigeenille;

3) isotoninen natriumkloridiliuos.

Testimateriaalista otettu sively käsitellään leimatulla antiseerumilla.

AG-AT-reaktio tapahtuu. Luminesenssimikroskooppitutkimus alueella, jossa AG-AT-kompleksit sijaitsevat, paljastaa leiman fluoresenssin (kuvio 34).

Komponentit epäsuora RIF, tarkoitettu influenssa A:n pikadiagnostiikkaan:

1) influenssaepäilyn potilaan nenänielun testiainepesut;

2) spesifinen antiseerumi, jossa on vasta-aineita influenssa A -virusta vastaan;

3) antiglobuliiniseerumi (AT immunoglobuliinia vastaan), joka on leimattu fluorokromilla;

4) isotoninen natriumkloridiliuos.

Testimateriaalista otettu sively käsitellään ensin halutun antigeenin immuuniseerumilla ja sitten leimatulla antiglobuliiniseerumilla.

Immuunikompleksit AG-AT -leimattu AT havaitaan fluoresoivalla mikroskoopilla.

Epäsuoran menetelmän etuna on, että ei tarvitse valmistaa laajaa valikoimaa fluoresoivasti spesifisiä seerumeita ja käytetään vain yhtä fluoresoivaa antiglobuliiniseerumia.

varten influenssa A serologinen diagnoosi, eli influenssa A -viruksen vasta-aineiden havaitsemiseen veren seerumissa käyttämällä epäsuora RIF käytä influenza diagnostiikkaa (influenssa A -viruksen antigeeni). Serodiagnostiikka virusinfektiot on pääasiassa retrospektiivinen ja sitä käytetään diagnoosin ja epidemiologisen analyysin vahvistamiseen.

Entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA): kilpaileva menetelmä (hepatiitti B -viruksen HBs-AG:n määritys) ja epäsuora menetelmä (HIV-infektion serologinen diagnoosi)

Entsyymi-immunomääritys (ELISA)

Entsyymejä käytetään leimana: peroksidaasi, alkalinen fosfataasi jne.

Reaktion indikaattori on entsyymien kyky aiheuttaa värireaktioita, kun ne altistetaan sopivalle substraatille. Peroksidaasin substraatti on esimerkiksi ortofenyylidiamiinin (OPD) tai tetrametyylibentsidiinin (TMB) liuos.

Yleisimmin käytetty kiinteän faasin ELISA (kuva 35), epäsuorat ja kilpailevat menetelmät (kuva 36).

ELISA-tulokset voidaan arvioida visuaalisesti ja mittaamalla optinen tiheys spektrofotometrillä (ELISA-analysaattori).

ELISA:n etuja ovat:

Vastausten arviointimenetelmien yksinkertaisuus;

Konjugaattien stabiilius;

Helposti automatisoitavissa.

Seuraavat ELISA-tyypit annetaan esimerkkeinä:

A) Kilpaileva tyyppi

Suunniteltu havaitsemaan hepatiitti B -viruksen (HBs Ag) pinta-antigeeni veriseerumissa ja plasmassa diagnostiikan aikana virushepatiitti B ja HBs Ag:n kuljetuksen määrittäminen.

Komponentit:

1) testimateriaali - seerumi tai veriplasma;

2) polystyreenimikrolevyn kuopan pinnalle adsorboituneet HBs Ag:n vasta-aineet;

3) konjugaatti - hiiren monoklonaaliset vasta-aineet HBs Ag:lle, jotka on leimattu peroksidaasilla;

4) ortofenyleenidiamiini (OPD) - substraatti;

5) fosfaatti-suolaliuospuskuri;

6) kontrolliseerumit:

Positiivinen (seerumi HBs Ag:lla);

Negatiivinen (seerumi ilman HBs Ag:tä).

Edistyminen:

2. Inkubointi 1 tunti 37 °C:ssa.

3. Kaivojen pesu.

4. Konjugaatin esittely.

5. Inkubointi 1 tunti 37 °C:ssa.

6. Kaivojen pesu.

7. OFD:n käyttöönotto. HBs Ag:n läsnä ollessa kuopissa oleva liuos muuttuu keltaiseksi.

8. ELISA:n laskeminen suoritetaan optisella tiheydellä käyttämällä fotometriä. Optisen tiheyden aste on kääntäen verrannollinen tutkitun HBs Ag:n pitoisuuteen.

Reaktio etenee kolmessa vaiheessa:

1. Tutkitun seerumin (plasman) HBs Ag sitoutuu homologisiin vasta-aineisiin, jotka ovat adsorboituneet kuopan pintaan. IR AG-AT muodostuu. (HBs Ag - anti HBs AT).

2. Peroksidaasilla leimatut HBs Ag:n vasta-aineet sitoutuvat AG-AT-kompleksin jäljellä oleviin vapaisiin HBs Ag -determinantteihin. Muodostuu kompleksi AT-AG-leimattua AT:tä (anti HBs AT - HBs Ag - anti HBs AT leimattu peroksidaasilla).

3. OPD on vuorovaikutuksessa AT-AG-AT-kompleksin peroksidaasin kanssa ja tapahtuu keltaista värjäytymistä.

B) epäsuora tyyppi

Se on tärkein testireaktio HIV-infektion diagnosoinnissa.

Tarkoitus: HIV-infektion serologinen diagnoosi - HIV-antigeenien vasta-aineiden havaitseminen.

Komponentit:

1) testimateriaali - veriseerumi (AB - AG-m HIV);

2) synteettiset peptidit, jotka jäljittelevät kahta HIV-antigeeniä: gp 120 ja gp 41, adsorboituina polystyreenikuopan pintaan;

3) peroksidaasilla leimattu antiglobuliiniseerumi, joka on saatu immunisoimalla kaneja ihmisen globuliineilla (AT - AT);

5) fosfaattipuskuroitu suolaliuos;

6) kontrolliseerumit:

positiivinen;

Negatiivinen.

Edistyminen:

1. Kontrolli- ja testiseerumien esittely.

2. Inkubointi 30 minuuttia 37 °C:ssa.

3. Pesu.

4. Entsyymileimatun antiglobuliiniseerumin käyttöönotto.

5. Inkubointi 30 minuuttia 37 °C:ssa.

6. Pesu.

7. OFD:n käyttöönotto.

Reaktio etenee 3 vaiheessa:

1. Tutkitun seerumin HIV-vasta-aineet sitoutuvat homologisiin antigeeneihin (gp 120 ja gp 41), ja IR AG-AT (HIV AG - AT to HIV) muodostuu sorbentin pinnalle.

2. Peroksidaasilla leimatun IC AG-AT-AT:n muodostuminen, koska Tutkitun seerumin vasta-aineet ovat antigeenejä antiglobuliiniseerumille.

3. OPD on vuorovaikutuksessa AG-AT-AT-kompleksin peroksidaasin kanssa ja kuoppaliuos värjäytyy keltaiseksi. Tutkinto entsymaattinen aktiivisuus on suoraan verrannollinen tutkittujen vasta-aineiden pitoisuuteen.

Reaktio perustuu siihen, että immuuniseerumit käsitellään fluorokromeilla (FITC), jotka yhdistetään vasta-aineisiin. Seerumit eivät menetä immuunispesifisyyttään. Kun tuloksena oleva luminoiva seerumi on vuorovaikutuksessa vastaavan antigeenin kanssa, muodostuu spesifinen valokompleksi, joka on helposti havaittavissa luminoivassa mikroskoopissa.

Erilaisia ​​immunofluoresoivia seerumeita voidaan käyttää suoraan ja epäsuoraan immunofluoresenssiin. Suorassa menetelmässä kullekin mikrobille valmistetaan spesifiset fluoresoivat immuuniseerumit immunisoimalla kani tapetulla taudinaiheuttajaviljelmällä, jonka jälkeen kanin immuuniseerumi yhdistetään fluorokromiin (fluoreseiini-isosyanaatti tai isotiosyanaatti). Menetelmää käytetään ekspressiodiagnostiikassa bakteeri- tai virusantigeenien havaitsemiseksi.

Epäsuorassa menetelmässä käytetään ei-fluoresoivaa diagnostista immuuniseerumia (immunisoitu kani tai sairas henkilö) ja fluoresoivaa seerumia, joka sisältää vasta-aineita diagnostisten seerumilajien globuliineja vastaan.

Työ nro 3

Entsyymi-immunomääritys (IFA)

Entsyymi-immunosorbenttimääritystä (ELISA) käytetään laajalti. Se perustuu siihen, että proteiinit adsorboituvat voimakkaasti esimerkiksi polyvinyylikloridista levyille. Yksi yleisimmistä ELISA-varianteista käytännössä perustuu saman spesifisyyden omaavien entsyymileimattujen spesifisten vasta-aineiden käyttöön. Liuos, jossa on analysoitu antigeeni, lisätään kantajaan, jossa on immobilisoituja vasta-aineita. Inkuboinnin aikana kiinteälle faasille muodostuu spesifisiä antigeeni-vasta-ainekomplekseja. Sitten kantaja pestään sitoutumattomista komponenteista ja lisätään entsyymillä leimattuja homologisia vasta-aineita, jotka sitoutuvat komplekseissa oleviin antigeenin vapaisiin valensseihin. Toisen inkubaation ja näiden entsyymileimattujen vasta-aineiden ylimäärän poistamisen jälkeen määritetään kantajaan kohdistuva entsymaattinen aktiivisuus, jonka arvo on verrannollinen tutkittavan antigeenin alkupitoisuuteen.

Toisessa ELISA-muunnelmassa testiseerumia lisätään immobilisoituun antigeeniin. Inkubaation ja sitoutumattomien komponenttien poistamisen jälkeen entsyymileimattuja antiglobuliinivasta-aineita käyttämällä havaitaan spesifiset immunokompleksit. Tämä menetelmä on yksi yleisimmistä ELISA-määrityksessä.

Spesifinen testimateriaali - Spesifinen vasta-ainesubstraatti

patogeenin vasta-aineet peroksidaasilla

Tutkittu AGS, merkitty

seerumin peroksidaasi Substraatti for

Spesifinen peroksidaasi

Ohjaus:

positiivinen - peroksidaasilla leimattu immuuniseerumi + substraatti - 2 kuoppaa;

negatiivinen - normaali seerumi + substraatti - 2 kuoppaa.

RIF:n (Coons-reaktio) asettamiseen on kaksi vaihtoehtoa - suora ja epäsuora immunofluoresenssireaktio.

Suora RIF on yksinkertainen yksivaiheinen reaktio, mutta koska se vaatii suuren määrän

leimatut antimikrobiset seerumit, silloin se on harvemmin epäsuoraa, jonka tuotannon tarjoaa yksi leimattu antiseerumi.

Epäsuora RIF on kaksivaiheinen reaktio, jossa antigeeni sidotaan ensin leimaamattomaan lajiseerumiin, ja sitten muodostunut antigeeni-vasta-aine-immuunikompleksi käsitellään FITC-leimatulla antiseerumilla, joka sisältää vasta-aineita tämän kompleksin immunoglobuliinia vastaan. Yleensä sen formulaatiovaiheessa I lajiseerumina käytetään kanin immuuniseerumia, joka on saatu immunisoimalla eläimiä vastaavalla mikro-organismilla, ja vaiheessa II FITC-leimattua kanin gammaglobuliineilla immunisoitujen aasien tai muiden eläinten anti-kaniseerumia ( kuva 9).

Suora RIF-asetus. Rasvattomalla lasilevyllä testattavasta materiaalista tehdään ohuita sivelyjä ja elimistä ja kudoksista smears-jäljet. Valmisteet kuivataan, kiinnitetään, niille levitetään luminesoiva seerumi, joka on otettu työlaimennoksessa, ja asetetaan kosteaan kammioon 37 ° C:n lämpötilaan 20-30 minuutiksi (25-40 minuutiksi - huoneenlämpötilaan). Sitten ylimääräisten fluoresoivien vasta-aineiden poistamiseksi valmistetta pestään puskuroidussa isotonisessa natriumkloridiliuoksessa 10-15 minuuttia, minkä jälkeen huuhdellaan tislatussa tai juoksevassa vedessä 10 minuutin ajan. Kuivataan huoneenlämmössä ja tutkitaan fluoresoivassa mikroskoopissa käyttäen öljyimmersiojärjestelmää.

Bakteerisolujen spesifisen fluoresenssin intensiteetin arvioimiseksi käytetään neljän plus-asteikkoa: "++++", "+++" - erittäin kirkas ja kirkas; "++", "+" - solujen selvä ja heikko paksusuolen vihreä fluoresenssi. Kolme kontrollia ovat pakollisia: 1) käsittely homologisten bakteerien fluoresoivilla vasta-aineilla (positiivinen kontrolli); 2) heterologinen viljelmä (negatiivinen kontrolli); 3) infektoitumaton materiaali (negatiivinen kontrolli).

Antikomplementaarinen RIF. Reaktio on CSC:n modifikaatio, jossa antikomplementaariset vasta-aineet, jotka on leimattu FITC:llä, toimivat indikaattorijärjestelmänä (kuvio 10).

Epäsuora anti-komplementaarinen RIF asetetaan seuraavasti: antigeenivalmiste valmistetaan lasilevylle, kuten RIF, mutta vaiheessa I sitä ei käsitellä yhdellä immuuniseerumilla, vaan sen seoksella marsun komplementin kanssa, ja vaiheessa I. II antiseerumilla, joka sisältää FITC-leimattuja vasta-aineita komplementtia varten. Anti-komplementaarisen RIF:n laajaa käyttöä rajoittaa anti-komplementaaristen vasta-aineiden saamisen vaikeus ja tapa, jolla ne on "leimattu".