Выделение вирусов на куриных эмбрионах. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах Куриные эмбрионы при диагностике вирусных инфекций

Куриные эмбрионы -- очень дешевая и удобная система культивирования вирусов гриппа. В эмбрионах в той или иной степени размножаются почти все штаммы вирусов как человеческого, так и животного происхождения. Наилучшим образом адаптированные к этой системе лабораторные штаммы дают в эмбрионах достаточно высокие титры, или 10--10 БОЕ на 1 эмбрион). Кроме того, эмбрион изолирован от внешней среды, и поэтому для размножения в нем вируса не нужно создавать специальные стерильные условия.

Вирус обычно вводят в заполненную жидкостью аллантоисную полость яйца, откуда он может проникнуть в хорионаллантоисную оболочку и заразить образующие ее клетки. Вирусное потомство выходит в аллантоисную жидкость и может быть легко извлечено из яйца путем отсасывания этой жидкости. Некоторые штаммы, в частности новые природные изоляты, а также вирусы типа С плохо размножаются на хорио-каллантоисной оболочке, но размножаются при введении непосредственно в амниотическую полость; при этом вирус получает доступ к разнообразным тканям эмбриона, и образующееся потомство выходит в амниотическую жидкость, которую можно извлечь отдельно.

Вирус лучше всего размножается в 10--12-дневных эмбрионах. Следует закупать свежие оплодотворенные яйца и инкубировать их нужное время в лаборатории. Для этого не обязательно иметь специальное оборудование, однако инкубатор очень удобен. Тем не менее яйца можно успешно инкубировать и в обычном термостате во влажной атмосфере при 37 °С, если их регулярно переворачивать. Сортность яиц не имеет особого значения, но в отдельных случаях важно исключить возможность заражения яйца другими микроорганизмами; некоторые поставщики продают специальные незараженные яйца.

Перед заражением следует убедиться в том, что яйца действительно оплодотворены. Для этого достаточно рассмотреть яйцо вблизи яркого источника света в темной комнате. Через 4--5 дней после оплодотворения эмбрион должен быть ясно виден.

При стандартном пассировании лабораторных штаммов вирусный инокулят обычно представляет собой образец инфицированной аллантоисной или культуральной жидкости. Как правило, образцы перед использованием разводят солевым раствором Хэнкса до концентрации вируса 10--10 БОЕ/мл, поскольку введение в яйцо большого количества вируса способствует образованию ДИЧ. Если перед заражением разведенный вирус приходится хранить, то в раствор для разведения следует ввести желатин. Естественно, необходимо обеспечить стерильность вируса, используемого для заражения; в тех случаях, когда это затруднительно, к инокуляту добавляют антибиотик гентамицин.

Данные методы предполагают использование гомогенизации для измельчения образцов, низкоскоростного центрифугирования для их осветления и введение неразведенного супернатанта в амниотическую полость.

Заражение эмбрионов.

I. Введение вируса в аллантоисную полость

• 1. Яйца кладут на бок и протирают сверху спиртом для стерилизации участка вокруг точки заражения.
• 2. В скорлупе проделывают небольшое отверстие с помощью зубоврачебного сверла, снабженного режущим диском. Отверстие должно быть достаточно глубоким, чтобы в него можно было ввести иглу для инъекций, но желательно не повреждать внутреннюю мембрану скорлупы.
• 3. С помощью шприца с иглой № 25 в аллантоисную полость инокулируют 0,1 мл вируса, вводя при этом иглу непосредственно под скорлупу.
• 4. Отверстие в скорлупе запечатывают небольшим количеством расплавленного воска.
• 5. Зараженные яйца инкубируют в термостате во влажной атмосфере острым концом вниз. Во время инкубации нет необходимости переворачивать яйца.

II. Введение вируса в амниотическую полость

• 1. Тупой конец яйца стерилизуют, протирая спиртом, и проделывают небольшое отверстие, как показано на схеме.
• 2. Яйцо располагают вблизи яркого источника света в темной комнате так, чтобы был виден эмбрион.
• 3. Иглу № 23 длиной 4 см вводят в проделанное отверстие, а затем резким движением в направлении эмбриона -- в амниотическую полость. При этом вносят 0,1 мл вируса и осторожно извлекают иглу.
• 4. Отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным воском и инкубируют яйца, как указано выше.

Время инкубации.

Оптимальное время инкубации, необходимое для получения максимального выхода вируса, зависит от конкретного штамма и должно быть определено экспериментально. Для некоторых штаммов вируса гриппа А, например вируса чумы птиц, максимальный выход достигается через 24--26 ч, в то же время большинство штаммов вируса гриппа А человека, а также вирусы типов В и С требуют 48--72 ч инкубации.

Сбор вируса.

Прежде чем пытаться извлечь из яйца вируссодержащую жидкость, рекомендуется охладить яйцо в течение 4--18 ч при 4°С или в течение 30 мин при --20 °С. При охлаждении эмбрион погибает, а окружающие его кровеносные сосуды сужаются. Таким образом, значительно уменьшается возможность контаминации вируссодержащей жидкости эритроцитами, которые могут связать часть вируса и тем самым уменьшить его выход. Если контаминации эритроцитами избежать все же не удается, потери вируса можно свести к минимуму, инкубируя материал 30 мин при 37 °С. В этих условиях вирионная нейраминидаза разрушает рецепторы эритроцитов, с которыми связывается вирус, и он освобождается.

I. Сбор аллантоисной жидкости

• 1. Яйца помещают на подставку тупым концом вверх и стерилизуют их поверхность спиртом.
• 2. Тупой конец яйца вскрывают, пользуясь при этом либо стерильным пинцетом, либо специальным приспособлением. Скорлупу вокруг воздушного мешка удаляют, открывая доступ к аллантоисной полости.
• 3. С помощью стерильного пинцета с тупыми концами разрывают хорионаллантоисную мембрану и отодвигают ее к краю яйца.
• 4. Эмбрион и желточный мешок осторожно отодвигают пинцетом и отсасывают аллантоисную жидкость пипеткой с широким концом. Из яйца среднего размера получают 7--10 мл бледно-желтой жидкости. Примесь желтка в аллантоисной жидкости мешает дальнейшей очистке вируса, поэтому при ее отборе следует избегать повреждения желточного мешка. Если вирус предназначен для биохимических исследований, например для анализа активности вирионных ферментов, аллантоисную жидкость следует собирать при 0 °С.
• 5. Аллантоисную жидкость осветляют центрифугированием 10 мин при 10 000 g и хранят супернатант при 4 или --70 °С.

II. Сбор амниотической жидкости

• 1. Поверхность яйца стерилизуют и вскрывают тупой конец, как описано выше. Удаляют возможно большую часть^ скорлупы, чтобы легко было извлечь содержимое яйца.
• 2. Хорионаллантоисную мембрану разрывают и выливают содержимое яйца в стерильную чашку Петри. При этом амнио-тическая полость должна остаться неповрежденной.
• 3. С помощью шприца с иглой № 25 из амниотической полости по возможности более полно извлекают содержимое.
• 4. Амниотическую жидкость осветляют и хранят так же, как и аллантоисную жидкость.

Ожидаемый выход.

Интенсивность размножения вируса в эмбрионах зависит от конкретного штамма. Дикие штаммы первоначально дают очень низкие титры, но после нескольких пассажей на эмбрионах титр значительно возрастает. Для разных лабораторных штаммов, адаптированных к размножению на эмбрионах, выход также существенно варьирует, но в большинстве случаев в аллантоисной жидкости накапливается 2000--5000, а иногда и до 20 000 ГАЕ/мл вируса. Очевидно, что адаптация к размножению в эмбрионах связана с селекцией генетических вариантов, поэтому следует иметь в виду, что результаты детального генетического и биохимического исследования штаммов, пассированных на эмбрионах, не обязательно характеризуют исходный изолят.

Выделение вирусов на лабораторных животных.

Выбор лабораторных животных зависит от вида вируса. Лабораторные животные являются биологической моделью. Иногда приходится проводить 3-5 «слепых», безсимптомных пассажей, прежде чем удастся адаптировать вирус к лабораторным условиям. Однако, к некоторым вирусам лабораторные животные не чувствительны, в этом случае приходится использовать естественно восприимчивых животных. Как, например, при чуме свиней и инфекционной анемии лошадей.

Цель заражения лабораторных животных:

1. Изучить патогенез болезни;

2. Выделить вирус из пат.материала;

3. Наработка иммунных и гипериммунных сывороток;

4. Наработка вакцин;

5. Поддержание вирусов в условиях лаборатории;

6. Титрация, с целью определения количества вируса в единице объема;

7. Биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;

Выбор метода заражения лабораторных животных зависит от тропизма вируса. Так, при культивировании нейротропных вирусов животных заражают в мозг; респираторных интранозально, интратрахеально; дерматропных - подкожно и внутрикожно.

Заражение производят с соблюдением правил асептики и антисептики.

Различают много способов введения вируссодержащего материала в организм животных:

Подкожный; - Интрацеребральный; - Внутрикожный;

Интраперитониальный; - Внутримышечный; - Интраокулярный;

Внутривеннвй; - Интранозальный; - Алиментарный;

После заражения животных метят, помещают их в изолированный бокс и ведут наблюдение в течение 10 суток. Гибель животного в первые сутки после заражения считается неспецифичной и в дальнейшем не учитывается.

3 признака указывают на результативность заражения:

Наличие клинических признаков

Гибель животного

Патологоанатомические изменения (величины, формы, цвета и консистенции органа).

Куриный эмбрион - это оплодотворенное куриное яйцо, в котором развивается зародыш (эмбрион). Культивирование вирусов на куриных и перепелиных эмбрионах в последнее время получило широкое распространение как один из наиболее простых и надежных методов культивирования и диагностики многих вирусов и некоторых бактерий - бруцеллы, риккетсии, вибрионы.

Многие вирусы человека и животных способны культивироваться в развивающихся куриных эмбрионах. Эмбриональная ткань, особенно оболочки эмбриона, богатые тканями зародышевого эпителия, является благоприятной средой для размножения многих вирусов. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, ИЛТ и др.), успешно развиваются на хорионаллантоисной мембране, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители миксовирусов (грипп, болезнь Ньюкасла, чума плотоядных и др.), вирусы инфекционного бронхита, гепатита утят, арбовирусы и др. хорошо размножаются в эмбрионе при введении материала в аллантоисную полость. Некоторые вирусы успешно культивируются в желточном мешке.

Преимущества:

1. Экономически выгодно, кроме того яйца легко доступны;

2. У развивающихся куриных эмбрионов отсутствуют защитные механизмы, т.к. система иммунитета еще не развита;

3. Скорлупа яиц препятствует проникновению через неё бактерий и вирусов из окружающей среды;

Для культивирования и выделения вирусов на куриных эмбрионах требуется очень несложное оборудование - обычный термостат или инкубатор.

Условия:

1. Яйца получают из хозяйств заведомо благополучных по инфекционным заболеваниям;

2. Куриные эмбрионы лучше получать от белых пород кур (леггорн, русская белая), т. к. они более устойчивы к манипуляциям и не гибнут от маленьких травм. Кроме того, у них скорлупа белая и более прозрачная, чем у других пород, и легче просвечивается, что удобно для просмотра и наблюдения в процессе работы с ними;

3. Для инкубирования отбирают оплодотворенные яйца снесенные не более 10 суток тому назад;

4. Берут незагрязненные яйца, т. к. мыть их перед инкубированием нельзя, а грязные яйца хуже просвечиваются при просмотре (овоскопии) и при работе с ними можно инфицировать эмбрион в процессе манипулирования;

Инкубируют яйца в инкубаторе или в термостате с водяным нагревом и доступом воздуха, причем в процессе инкубации в термостате яйца 2-3 раза в сутки нужно переворачивать и для лучшего газообмена вынимать на 5-10 минут на воздух. Для поддержания определенной влажности в термостат ставят сосуд с водой для испарения, температура в термостате должна быть 38°.

Развитие зародыша происходит уже в первые сутки инкубирования, происходит закладка головного мозга, скелета. Строение куриного эмбриона в возрасте 7-9 дней (см. тетрадь).

Для заражения наиболее часто используют эмбрионы 7-12 суточного возраста. Работу с куриными эмбрионами проводят в стерильной комнате-боксе со строжайшим соблюдением асептики.

Цель заражения куриных эмбрионов:

1. Выделить вырус из пат.материала;

2. Наработка вакцин;

3. Поддержание вируса в условиях лаборатории;

4. Титрация вирусов;

5. Биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;

6. Изучение интерференции вирусов и наработка интерферона; Заражение куриных эмбрионов:

Для заражения нужно отбирать жизнеспособные эмбрионы с хорошо выраженной подвижностью. Перед заражением все эмбрионы тщательно просматривают в затемненной комнате на овоскопе

Во время просвечивания эмбрионов перед заражением на скорлупе простым карандашом обрисовывают пугу (воздушную полость), ход крупных кровеносных сосудов и место предлежания эмбриона, т. е. участок на скорлупе, где ближе всего к ней лежит эмбрион. Отметка пуги, места предлежания эмбрирна и хода крупных кровеносных сосудов затем служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала в момент заражения.

Отобранные для заражения куриные эмбрионы переносят в бокс, где и проводят с ними работу. Перед заражением скорлупу по месту введения материала дважды обрабатывают йодированным спиртом и обжигают. Доза заражения составляет 0,1-0,2 см.

В зависимости от вида вируса и цели заражения имеются различные методы введения вируссодержащего материала:

1) Заражение на хорионаллантоисную оболочку , используют эмбрионы 7-12-суточного возраста при выделении и культивировании нейротропных, дерматропных н некоторых пантропных вирусов (оспа, энцефаломиелит, ИЛТ, ящур, бешенство, чума и др.). Существует 3 варианта заражения:

а) вскрывают пугу и срезают ее ножницами, отделяют подскорлупную оболочку и наносят на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) материал. Отверстие в яйце затем закрывают стерильным стеклянным колпачком и края колпачка парафинируют;

б) выпиливают надфилем (напильничек) или зазубренным скаль­пелем в скорлупе треугольник с длиной сторон около 1 см на границе пуги со стороны предлежания эмбриона, пинцетом удаляют участок скорлупы и подскордупной оболочки и вводят материал. Отверстие закрывают покровным стерильным стеклом и края парафинируют, или заклеивают стерильным лейкопластырем.

в) скальпелем удаляют небольшой участок скорлупы площадью около 0,5 см по месту предлежания эмбриона, затем пинцетом или иглой удаляют в этом участке подскорлупную оболочку и вводят материал. Если материал плохо входит в полость яйца, можно с помощью резиновой груши через отверстие в скорлупе на пуге откачать воздух из пуги и в результате по месту введения материала образуется искусственная пуга и тогда материал легко вводится. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.

2) Заражение в аллантоисную полость. Этот метод заражения очень прост и применяется для выделения многих вирусов. Для заражения берут 10-11-дневные эмбрионы. Имеется два варианта заражения:

а) заражение проводят через пугу, не срезая ее. Иглой отмеряют расстояние от верхушки пуги до границы пуги, отмеченной карандашом на скорлупе, и вводят иглу на отмеченную глубину и углубляют еще на 0,5 см, чтобы проколоть хорионаллантоисную оболочку;

б) вводят материал иглой через прокол в скорлупе в месте предлежания эмбриона на глубину 3-5 мм в бессосудистом участке. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.

3) Заражение в желточный мешок. Для заражения используют 5-8-суточные эмбрионы. Существует два варианта заражения:

а) иглу вводят со стороны пуги в желточный мешок под углом 45° к месту предлежания эмбриона под контролем овоскопа;

б) яйцо кладут на подставку также местом предлежания эмбриона вниз и иглу вводят сверху вниз по направлению к эмбриону на глубину около 1 см.

Место введения заклеивают лейкопластырем и парафинируют. 4) Заражение в амниотическую полость. При этом методе заражения вирус может проникнуть в различные клетки, находящиеся в контакте с амниотической жидкостью, и размножаться в них. для удобства заражения рекомендуется за 2-3 дня до проведения заражения эмбрионы инкубировать пугой вверх. Тогда эмбрион и амнион смещаются вверх и удобнее заражать. Имеется два варианта заражения:

а) вскрывают и срезают пугу, пинцетом удаляют подскорлупную оболочку и захватывают амниона подтягивают амнион пинцетом и вводят в амниотическую полость материал в дозе 0,1 мл. Отверстие в скорлупе затем закрывают стерильным стеклянным колпачком и края парафинируют;

б) заражение с помощью длинной иглы через пугу в темной комнате под контролем глаза, У иглы предварительно острие загибают под прямым углом, чтобы получилась маленькая площадка. Иглу вводят под контролем глаза через пугу доэмбриона, под давлением затупленной иглы эмбрион в этом случае будет смещаться, затем легким толчком прокалывают амнион и иглу слегка оттягивают назад. При этом эмбрион должен смещаться за иглой вверх. Затем вводят материал.

5) Заражение в тело эмбриона и заражение в головной мозг. Используются 7-12-дневные эмбрионы, заражение проводят введением материала в различные участки тела или непосредственно в головной мозг. Для заражения вскрывают пугу и подтягивают пинцетом эмбрион. При этих методах заражения может быть гибель эмбрионов от травмы до 30 % и более от числа зараженных.

6) Заражение в крупные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки. Этот метод заражения, как и предыдущий, применяется очень редко. Материал вводят тонкой иглой после удаления скорлупы по ходу кровеносного сосуда непосредственно в сосуд по току крови.

После заражения куриные эмбрионы обязательно метят простым карандашом и ставят в термостат. За ними ежедневно наблюдают путем просмотра, наблюдение ведут до 7-8 дней в зависимости от вида вируса. В случае гибели эмбрионов их срочно удаляют из термостата и ставят в холодильник до момента вскрытия. Если эмбрион погиб в течение первых 14-18 часов, это может быть от травмы или токсичности патматериала. Поэтому, так же как и при заражении лабораторных животных, в сомнительных случаях рекомендуется, делать несколько пассажей и в опыт брать на каждый материал по несколько эмбрионов.

Вскрытие погибших зараженных куриных эмбрионов, или изъятых по истечении срока наблюдения производится со всеми правилами асептики в стерильных условиях бокса. При вскрытии скорлупу обрабатывают спиртом и обжигают, затем срезают пугу. У вскрытого эмбриона сначала тщательно отсасывают аллантоисную жидкость (количество ее около 7 мл), затем пинцетом оттягивают амниотическую оболочку, прокалывают пастеровской пипеткой и отсасывают амниотическую жидкость (количество ее 1,0-1,5 мл), затем собирают желток, извлекают оболочки и сам эмбрион. Жидкость, оболочки и сам эмбрион тщательно осматривают на наличие изменений. Амниотическая жидкость в норме совершенно прозрачная, при заражении она может быть мутная, кровянистая. Характерные изменения, вызванные вирусом, бывают наиболее выраженными на хорионаллантоисной оболочке: появляютсявоспалительные очаги, непрозрачные, круглой формы и кровоизлияния. Кровоизлияния могут быть на теле эмбриона. Весь материал собирают в стерильную посуду.

Куриные эмбрионы в вирусологии широко применяются не только для выделения вирусов, но и для накопления и получения антигенов, для приготовления живых и убитых вакцин, титрования вирусов, для постановки реакции нейтрализации вирусов, для аттенуирования (ослабления) вирусов, для изучения интерференции вирусов и получения интерферона.

Подготовила: преподаватель Угышева Ш.Е.

Слайд 3

Строение вирусов

Слайд 4

Структура вирусов A – простой вирус B – сложный вирус

Слайд 5

За своей степенью опасности вирусы разделяют на четыре группы: I группа: возбудители лихорадки Эбола, Ласса, Марбурга, Мачупо, натуральной оспы, а также вирус гепатита В (мартышек). ІІ группа: арбовирусы, некоторые аренавирусы, вирусы бешенства, вирусы гепатита С и В человека, ВИЧ. ІІІ группа - вирусы гриппа, полиомиелита, энцефаломиокардита, осповакцины. ІV группа - аденовирусы, коронавирусы, герпесвирусы, реовирусы, онковирусы.

Слайд 6

Слайд 7

Принципы классификации вирусов Тип нуклеиновой кислоты, ее структура, стратегия репликации Размеры, морфология, симметрия вириона, число капсомеров, наличие суперкапсида. Наличие специфических ферментов, особенно РНК- и ДНК-ПОЛИМЕРАЗ, нейраминидазы Чувствительность к физическим и химическим агентам, особенно к эфиру Иммунологические свойства Естественные механизмы передачи Тропизм к хозяину, его тканям и клеткам Патология, формирования включений Симптоматология заболеваний.

Слайд 8

Классификация вирусов (РНК- содержащие)

Слайд 9

Классификация вирусов (ДНК- содержащие)

Слайд 10

Химический состав вирусов В состав вирусов входит нуклеиновая кислота, белок, липиды, гликолипиды, гликопротеиды. Они всегда содержат один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), которая составляет от 1 % до 40 % массы вириона. Вирусные геномы содержат информацию, достаточную для синтеза лишь нескольких белков. Их масса достигает 10-15 мг, что в 1 млн. раз меньше, чем в клетки, а длина- до 0,093 мм Число нуклеотидных пар колеблется от 3150 (вирус гепатита В) до 230000 (вирус натуральной оспы). Белки вирусов (70-90 %) разделяются на структурные и неструктурные. Структурными - белки, которые входят в состав зрелых внеклеточных вирионов. Они выполняют ряд важных функций: - защищают нуклеиновую кислоту от внешнего повреждения взаимодействуют с мембранами чувствительных клеток обеспечивают проникновения вируса в клетку - имеют РНК- и ДНК-полиме-разную активность и др. Неструктурные белки не входят в состав зрелых вирионов, однако образуются во время их репродукции. Они: - обеспечивают регуляцию экспрессии вирусного генома - являются предшественниками вирусных белков, способные подавлять клеточный биосинтез. В зависимости от расположения в вирионе, белки разделяются на капсидные, суперкапсидные, матриксные, белки сердцевины и ассоциируемые с нуклеиновой кислотой. Липиды (15-35 %) содержатся в сложных вирусах и входят в состав суперкапсидной оболочки, образовывая ее двойной липидный слой. Они: - стабилизируют вирусную оболочку - обеспечивают защиту внутренних слоев вирионов от гидрофильных веществ внешней среды - принимают участие у депротеинизации вирионов.

Слайд 11

Репродукция вирусов. Особенности ее заключаются в том, что геномы представлен как РНК, так и ДНК, они многообра-зные за структурой и формой, почти все вирусные РНК способны реплицироватся независимо от ДНК клетки.Вирусам присущий дизъюнктивный способ репродукции, заключается в том, что синтез генома и белков вируса разорван в пространстве и времени: нуклеиновые кислоты реплиццируются в ядре клетки, белки - в цитоплазме, а сбор целых вирионов может происходить на внутренней пове-рхностицитоплазматичної мембраны. Репродукция вирусов - уникальная система воссоздания чужерод-ной информации в клетках эукариотов и обеспечивает абсолютное подчинение клеточных структур потребностям вирусов. В репродукции вирусов выделяют ряд стадий. К ранним принадлежит адсорбция вирусов на поверхности клетки, проникновение (пенетрация) их внутрь клетки и их раздевание (депротеинизация). Поздние стадии (стратегия вирусного генома) включают синтез вирусных нуклеиновых кислот, синтез белка, сбор вирионов и выход вирусных частиц из клетки.

Слайд 12

Прикрепление вирусов к поверхности клетки обеспечивается двумя механизмами: неспецифическим и специфическим. Неспецифический определяется силами электростатического взаимодействия, что возникает между химическими группами на поверхности вирусов и клеток, которые несут разные заряды. Специфический механизм (обратная и необоротная адсорбция) предопределяется комплементарними вирусными и клеточными рецепторами. Они могут иметь белковую, углеводную, липидную природу. Например, рецептором для вирусов гриппа является сиаловая кислота. Число рецепторов на участках адсорбции может достигать 3000. На поверхности вирусов рецепторы, как правило, расположены на дне углублений и щелей. Проникновение вирусов внутрь клетки происходит за механизмом рецепторного эндоцитоза (вариант виропексиса) на специальных участках клеточных мембран, которые содержат особенный блок с высокой молекулярной массой - клатрин. Мембраны инвагинируются, и образуются покрытые клатрином внутриклеточные вакуоли. их число может достигать 2000. Вакуоли, объединяясь, образуют рецептосоми, а последние сливаются с лизосомами. Поверхностные белки вирусов взаимодействуют с мембранами лизосом, а их нуклеопротеид выходит в цитоплазму. Однако существует еще один механизм проникновения вирусов в клетку - индукция слияния мембран. Она происходит благодаря особенному вирусному белку слияния (F- от fusion - слияние). В результате этого процесса вирусная липопротеидная оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а геном его проникает в клетку. Такой белок идентифицирован у вирусов гриппа, парагриппа, рабдовирусов и др.

Слайд 13

Раздевание вирионов - многостепенный процесс, во время которого высвобождается их нуклеиновый аппарат, исчезают защитные оболочки, которые тормозят экспрессию генома. Происходит оно в специализированных участок - лизосомах, аппарате Гольджи. Поздние стадии репродукции направлены на синтез вирусных нуклеиновых кислот и белка. Механизм репликации (образование вирусных геномов, которые являются точной копией предшественника) зависит от особенностей нуклеиновой кислоты. У разных видов вирусов он неодинаковый. Репликация у вирусов, которые содержат РНК, происходит за подобными закономерностями. На материнской РНК синтезируется ИРНК, а матрицей для синтеза вирусного генома служат промежуточные формы РНК. Транскрипцией называют процесс образования информационных (матричных) РНК. Она происходит с помощью специальных ферментов, которые называются ДНК- или РНК-зависимые РНК-полимеразы. У вирусов ДНК эти ферменты клеточного происхождения, а у РНК-вирусов - собственные вирусспецифическиетранскриптазы. На стадии трансляции происходит считывание генетической информации из матричной РНК и перевод ее в последовательность аминокислот. Происходит процесс в рибосомах. Молекулы РНК продвигаются в рибосомах в соответствии с последовательностью триплетного кода, который распознают транспортные РНК. Последние несут на специальных участках аминокислоты.

Слайд 14

Слайд 15

Слайд 16

Культивирование вирусов Куриные эмбрионы 6-12 дневного возраста. Способы заражения - открытый, закрытый

Слайд 17

Культивирование вирусов Культуры клеток: - первично-трипсинизированные культуры эмбрионов человека, почек мартышек, фибробластов эмбриона курицы и тому подобное; способные расти на протяжении нескольких пасса-жей как вторичные культуры; перевиваемые клетки; они представляют собой культуры клеток, которые приобрели способность к неограниченному росту и размножению; Их получают из опухолей или из нормальных человеческих или животных тканей, которые имеют измененный кариотип. HeLa (карцинома шейки матки) Hep-2 (карцинома гортани человека), КВ (карцинома ротовой полости человека), RD (рабдомиосаркома человека), RH (почка эмбриона человека), Vero (почка зеленой мартышки), СПЭВ (почка эмбриона свиньи), ВНК-32 (почка сирийского хомяка). Культуры клеток диплоидные клетки; они представляют собой культуры клетки одного типа, имеют диплоид-ный набор хромосом и способные выдерживать при этом до 100 пересеваний в условиях лабора-тории. Они являются удобной моделью для получения вакцинных препаратов вирусов, так как свободные от контаминации инородными вирусами, хранят исходный кариотип во время пассажей, не имеют онкогенной активности. Чаще всего пользуются линиями культур, которые получены с фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), коров, свиней, овец и тому подобное. Культуры клеток хранят в замороженном состоянии.

Слайд 18

Питательные среды, которые используются для поддержки культур клеток или их роста бывают естественными или синтетическими (искусственными). Естественные среды - сыворотка крови крупного рогатого скота, жидкости из серозных полостей, продукты гидролиза молока, многообразные гидролизаты (5 % гемогидролизат, 0,5 % гидролизатлактоальбумина) или экстракты тканей. Их химический состав помогает создать условия, какие подобные к тем, что существуют в организме человека. Существенным недостатком таких сред считается их нестандартность, ведь качественный и количественный состав компонентов, которые входят к их составу, может изменяться. Синтетические питательные среды не имеют этого недостатка, ведь их химический состав стандартен, потому что их получают комбинируя многообразные солевые растворы (витамины, аминокислоты) в искусственных условиях. К таким наиболее употребимым растворам принадлежат среда 199 (культивирование первинно-трипсинизированных и перевиваемых культур клеток), среда Игла (содержит минимальный набор аминокислот и витаминов и используется для культивирования диплоидных линий клеток и перевиваемых), среда ИглаМЕМ (культивирование особенно требовательных линий клеток), раствор Хенкса, что используется для изготовления питательных сред, отмывания клеток и тому подобное

Слайд 19

Слайд 20

Слайд 21

Заражение лабораторных животных. Многочисленные лабораторные животные широко используются в вирусологии для выделения и идентификации вирусов, получения специфических противовирусных сывороток, изучения многообразных аспектов патогенеза вирусных заболеваний, разработки способов борьбы с заболеваниями и их профилактики. Чаще всего используют белых мышей разного возраста (двухдневного возраста), белых крыс, гвинейских свинок, кролей, сусликов, хлопчатниковых крыс, мартышек и других.

Слайд 22

Существуют многообразные способы заражения животных в зависимости от тропизма вирусов, клинической картины заболевания. Исследуемый материал можно вводить: - через рот - в дыхательные пути (ингаляторно, через нос) - накожный - внутрикожно - подкожно, внутримышечный - внутривенно - внутрибрюшинно - внутрисердечно - на скарифицированную роговицу - в переднюю камеру глаза - в мозг.

Слайд 23

Слайд 24

Слайд 25

Слайд 26

Бактериофа́ги (фаги) (от др.-греч.φᾰγω - «пожираю») - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечнойнуклеиновой кислоты (ДНК или, реже, РНК). Размер частиц приблизительно от 20 до 200 нм. Независимо от Фредерика Туорта французско-канадский микробиолог Д’Эрель, Феликс 3 сентября 1917 год сообщил об открытии бактериофагов. Наряду с этим известно, что российский микробиолог Николай Фёдорович Гамалея ещё в 1898 году, впервые наблюдал явление лизиса бактерий (сибиреязвенной палочки) под влиянием перевиваемого агента. Жизненный цикл Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл. Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки. Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина. Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты. Деление клетки. Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь. Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогенный путь). Вирулентные бактериофаги развиваются по Литической модели: Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка. Нуклеиновая кислота фага реплицируется, и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим. Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200-1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии. 1 - головка, 2 - хвост, 3 - нуклеиновая кислота, 4 - капсид, 5 - «воротничок», 6 - белковый чехол хвоста, 7 - фибрилла хвоста, 8 - шипы, 9 - базальная пластинка

Слайд 27

Заражение куриного эмбриона Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения; на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и ам-ниотическую полость, в желточный мешок. Перед-заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением. Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, об­жигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0.05 - 0.2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой. Вскрытие эмбрионов производят через 48 - 72 часа инкубации в термоста­те. Наличие вируса в хролантоиской оболочке определяют: 1. По белесоватым непрозрачным пятнам разной формы; 2. В реакции гемаглютинации.

Слайд 28

Слайд 29

Слайд 30

Слайд 31

Спасибо!!!

Посмотреть все слайды

Добрый день, дорогие читатели! Мы сегодня дадим описание, покажем фото и видео про развитие цыпленка в яйце по дням во время инкубации в домашних условиях и на птицефабриках. уверенно практикуется как в фабричных масштабах, так и на частных подворьях.

Но, несмотря на широкое распространение, мало кто задумывается о сложном механизме, заложенном на генетическом уровне, обеспечивающим рост и развитие цыпленка.

До сих пор встречается мнение, что птенец вырастает из желтка. В этой статье вы узнаете все секреты, скрываемые под , а также что за «страшный» смысл скрывается под словами аллантоис у цыпленка и амнион у цыпленка, и какую функцию они выполняют.

Развитие цыпленка в яйце по дням фото

Бластодиск

Развитие цыпленка начинается с бластодиска. Бласодиск – это небольшой сгусток цитоплазмы, находящийся на поверхности желтка. В месте нахождения бластодиска плотность желтка значительно ниже, что способствует неизменному всплыванию желтка бластодиском вверх.

Эта особенность обеспечивает лучшее прогревание в процессе инкубации. Оплодотворенный бластодиск начинает деление еще в организме курицы и к моменту снесения он уже полностью окружен бластодермой. Выглядит бластодиск как небольшое белое пятнышко размером около 2 мм.

Светлый ореол, кольцом окружающий зародышевый диск является бластодермой.

При попадании яйца в благоприятные окружающие условия, остановившееся после снесения, деление клеток продолжается.

Следует знать: Вопреки распространенному мнению, что овоскопирование можно проводить только с 6 дня инкубации, развитие бластодермы хорошо просматривается через 18-24 часа от начала инкубации. К этому моменту отчетливо видно затемнение диаметром 5–6 мм, легко перемещающееся при переворачивании яйца.

На 2 – 3 сутки инкубации начинается развитие провизорных оболочек:

1. Амнион у цыпленка
2. Аллантоис у цыпленка

Все они являются, по сути, временными органами, призванными выполнять функции обеспечения жизнедеятельности зародыша до момента его окончательного формирования.

Амнион у цыпленка

Представляет собой оболочку, предохраняющую зародыш от физического воздействия и высыхания, благодаря наполнению жидкостью. Амнион у цыпленка регулирует количество жидкости в зависимости от возраста зародыша.

Эпителиальная поверхность амниотического мешка способна наполнять водой полость с эмбрионом, а также обеспечивает отток жидкости по мере его роста.

Аллантоис у цыпленка

Один из временных органов, выполняющий множество функций:

• снабжение эмбриона кислородом;
• изолирует от эмбриона отходы жизнедеятельности;
• участвует в транспорте жидкости и питательных веществ;
• осуществляет доставку минеральных веществ и кальция от скорлупы к зародышу.

Аллантоис у цыпленка, в процессе роста, создает разветвленную сосудистую сеть, которая выстилает всю внутреннюю поверхность яйца и соединяется с птенцом через пуповину.

Дыхание цыпленка в яйце

Кислородообмен в яйце в зависимости от стадии развития цыпленка имеет различный механизм. На начальной стадии развития, кислород поступает из желтка напрямую в клетки бластодермы.

С появлением кровеносной системы, кислород поступает уже в кровь, по-прежнему из желтка. Но желток не может полностью обеспечить дыхание быстрорастущего организма.

Начиная, с 6 дня функция обеспечения кислородом, постепенно, перекладывается на аллантоис. Рост его начинается в сторону воздушной камеры яйца и достигнув ее, покрывает все большую внутреннюю площадь скорлупы. Чем больше растет цыпленок, тем большую площадь покрывает аллантоис.

При овоскопировании он выглядит как розоватая сеть, охватывающая все яйцо и замыкающаяся с острой его стороны.

Питание цыпленка в яйце

В первые дни развития эмбрион использует питательные вещества белка и желтка. Так как в желтке содержится целый комплекс минеральных веществ, жиров и углеводов, он способен обеспечить все первоначальные потребности растущего организма.

После замыкания аллантоиса (11 день развития), происходит перераспределение функций. Зародыш, становится крупнее и принимает положение вдоль длинной оси яйца, головой к тупому концу. Белок к этому моменту сконцентрирован в остром конце яйца.

Вес птенца вкупе с давлением аллантоиса обеспечивает смещение белка и проникновение его через амнион в рот зародыша. Благодаря этому непрерывному процессу обеспечивается быстрый рост и развитие цыпленка в яйце по дням во время инкубации.

С 13 дня минеральные вещества, которые использует цыпленок для дальнейшего развития, доставляются аллантоисом от скорлупы.

Следует знать: Нормальное питание цыпленка, способен обеспечить, только своевременно замкнутый аллантоис у цыпленка. Если, при его смыкании, в остром конце яйца, остался не покрытый сосудами белок, цыпленку не хватит питательных веществ для дальнейшего роста.

Положение яйца и развитие цыпленка

В последнее время все шире практикуется инкубация куриных яиц в вертикальном положении. Но такой способ не самым лучшим образом сказывается на развитии цыпленка.

При вертикальном положении, максимальный наклон при поворотах равен 45°. Этого наклона недостаточно для нормального роста аллантоиса и своевременного его смыкания. Особенно это касается крупных яиц.

При инкубации в горизонтальном положении поворот обеспечивается на 180°, что положительно влияет на рост аллантоиса и как следствие питание птенчика.

Как правило, пушистики, выведенные при вертикальном положении яиц, имеют вес на 10% ниже, чем выведенные при горизонтальном положении.

Значение поворачивания яйца для развития цыпленка

Поворачивание яиц во время инкубации необходимо на всех стадиях развития, кроме первых суток и двух последних. В первые сутки необходимо интенсивное прогревание бластодиска, а в последние сутки маленький пискун уже принял положение для пробивания скорлупы.

На начальных стадиях развития поворачивание яиц устраняет риск прилипания бластодермы или амниона к внутренней стороне скорлупы.

Поворачивание также способствует:

• сокращению амниона;
• равномерности прогревания яиц;
• принятию эмбрионом правильного положения;
• улучшению газообмена;
• своевременному смыканию аллантоиса;
• улучшению питания зародыша.

Теперь, после прочтения статьи, можно судить о сложности процессов, происходящих с маленьким петушком или курочкой во время его развития от нескольких клеток до маленькой птички. Этот процесс не менее сложен, чем развитие человеческого ребенка или, например, котенка в утробе матери, где гарантированы постоянные условия.

Развитие цыпленка в яйце по дням полностью зависит от внешних условий, обеспечение которых и является инкубацией.

Желаем всем удачного вывода желтых, серых и других пушистиков!

Подпишитесь на обновления сайта, чтобы первыми узнать куриные новости, которые помогут решить все проблемы.

Вот фото от нашей постоянной читательный Юлии Арептевой, цыпленок вывелся под !

В комментариях вы можете добавить свои фото кур несушек, петуха и цыплят! Или другой домашней птицы. Нам интересно, какой у вас курятник?
Понравилась статья? Поделись с друзьями в соц.сетях:

Присоединяйтесь к нам ВКонтакте, читайте про кур!

Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут в большей или меньшей степени размножаться в курином эмбрионе. Наличие плотной скорлупы защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды.

Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также для изготовления вирусных вакцин и диагностических препаратов. Но этот метод имеет недостатки: 1) невозможно наблюдать в динамике за патологическими изменениями, происходящими в эмбрионе после заражения его вирусом; 2) при вскрытии эмбриона, зараженного вирусом, часто не обнаруживается видимых изменений и приходится выявлять наличие вируса в тканях, в жидкостях эмбриона, пользуясь другими вирусологическими методами (например, реакцией гемагглютинации); 3) метод культивирования в куриных эмбрионах пригоден не для всех вирусов. Несмотря на имеющиеся недостатки метод сравнительно прост, удобен и дешев и широко используется в вирусологических исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе с ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами.

1.3.1. Строение куриного эмбриона

Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой – скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, которая является органом выделения и защищает зародыш от высыхания и травм. Аллантоисная полость окружает зародыш, находящийся в полости амниона, которая наполнена околоплодной жидкостью. Через желточный канатик зародыш соединён с желточным мешком – основным источником питательных веществ.

Для успешного культивирования вирусов в организме развивающихся куриных эмбрионов требуется определённый температурный режим (36 0 -38 0), влажность (50-70%), а также достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определённого возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Необходимо подготовить: подставку для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирку со стерильным парафином, покровные стёкла, пакетики стерильной ваты и марли, завёрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иглы, пинцеты, препаровальные иглы. Инструменты помещают в стаканчик со спиртом, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипуляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Руки перед работой тщательно моют, рекомендуется надеть маску из марли.

Для работы отбирают жизнеспособные эмбрионы, просвечивая инкубированные яйца в овоскопе. Жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кровью. Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце (или на боковой стороне яйца): скорлупу протирают спиртом, смазывают йодом, повторно обрабатывают спиртом и обжигают.

1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку

Для заражения используют куриные эмбрионы 10-12-дневного возраста. Основные этапы заражения:

1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху, проводят стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.

2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

3. в образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и вырезают окно в скорлупе около 1,5 см в диаметре.

4. Через отверстие осторожно надрывают иглой внутренний листок скорлупной оболочки и отслаивают на небольшом участке (0,5-1 см 2).

5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки путём нанесения на неё 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала с помощью пастеровской пипетки или шприца.

6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной плёнкой или стерильным покровным стеклом и прикрепляют расплавленным парафином.

Заражённые эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:

1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное пространство было наверху, проводится стерилизация места вскрытия.

2. Стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного пространства.

3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку по границе. Обнажённую хорионаллантоисную оболочку подрезают вдоль края скорлупы. Через образовавшееся отверстие выливают всё содержимое яйца в чашку или лоток.

4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь её расправляют и изучают изменения, поместив чашку на тёмный фон.

Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, её нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочная жидкость используется в качестве вируссодержащего материала.

Рис. 3. Заражение куриных эмбрионов

1.3.3. Заражение в аллантоиную полость

Для заражения берут эмбрионы 10-11-дневного возраста. Основные этапы заражения:

1. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.

2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение вируса. Иглу продвигают в вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного мешка и затем вводят 0,1-0,2 мл материала.

4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью расплавленного стерильного парафина.

Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4 0 С. Вскрытие производится в следующем порядке:

1. Яйцо устанавливается на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют.

2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше границы воздушного пространства.

3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупную оболочку, после чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную жидкость.

4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на бактериологическую стерильность.